早在中共一大上，董必武就率先提出过与其他政党合作的主张，在中共三大上，他的主张得以实现，国共合作组成统一战线的方针正式确立。1924年1月，国民党一大召开，大会通过了以反帝反封建为主要内容的宣言，确定“联俄、联共、扶助农工”的三大政策，共产党员和共青团员可以个人身份参加国民党，国共开始第一次合作。1925年春，按中共汉口地委和上级中共组织的指示，董必武离开武汉中学，专门从事中共的工作和对国民党的统战工作。在他的领导下，国民党各级党组织逐步建立起来，湖北先后有17个县建立了国民党组织，这些市县党部的委员基本上都是由中共党员和共青团员担任。同年7月，董必武主持国民党湖北省第一次代表大会，组建国民党湖北省党部，当选为省党部执行委员。1926年1月，他作为国民党湖北省党部代表，出席国民党二大，向大会作了《中国国民党湖北省党务工作报告》，当选为国民党中央候补执行委员。根据《工作报告》的统计，从国共合作建立起至1925年10月，湖北省的国民党员发展到1877人，其中工人、农民、青年学生就有1415人，占总数的70%以上。国民党汉口特别市党部中工人党员占大多数。与此同时，董必武积极发展中共地方组织，他以武汉中学为基地，培养一批革命青年加入中共，然后派回湖北各县发展党的组织。1925年秋，在七里坪建立了中共黄安党团特别支部。这年冬，建立了中共麻城特别支部，接着，黄冈、黄梅、黄陂、大冶、沔阳、监利、襄阳等县相继建立中共组织。①l926年4月，湖北全省中共党员发展到400多人，工、妇、学、青等群众团体全省性领导机构相继建立。
为了加强国民党的组织建设，推动反帝反封建革命运动，在董必武领导下，湖北省党部成立后又先后召开了三次全省代表大会。1926年2月，召开了国民党湖北省二大，大会健全了省党部的工作机构，增设了商民部，妇女运动委员会和临时指挥部。同年7月召开的国民党湖北省三大，通过了多个决议案及宣言、通电。1927年1月，国民党湖北省四大召开。董必武担任大会主席团主席，作了开幕词和闭幕词，重点阐述了开展农民运动的重要性，并当选为执行委员和常务委员。国民党湖北省党部是在共产党领导下的、以共产党人和国民党左派为主而组成的民主革命联盟，其领导权牢牢地掌握在共产党人手中。到5月底，全省有国民党党部组织的县市发展到四个，全省国民党员达9万余人。
为了加强反帝反封建的宣传工作，董必武先后创办了《楚光日报》和《汉口民国日报》，大量登载工人运动、农民运动的消息，不断抨击北洋军阀的黑暗统治；同时宣传中共的主张，揭露国民党右派反对和破坏国共合作的反动事实，推动两党的国民革命运动。为了加强三民主义和三大政策的研究和宣传，董必武还创办了湖北省立中小学教师党义研究所，亲自兼任所长。该所在1927年上半年先后办了两期，招收研究员共600余名，开设了《社会进化史》《各国革命史》《三民主义》《不平等条约》《青年运动之意义与方法》等课程。《楚光日报》《汉口民国日报》以及党义研究所的创办，宣传反帝反封建的主张，起到了巩固第一次国共合作的政治基础和思想基础的作用。
第一次国共合作后，董必武参与指导了湖北人民的反帝反封建斗争。1924年9月，成立了“武汉反帝国主义运动大同盟”，董必武当选为执委。1926年春，董必武以国民党代表身份和广东国民政府代表陈铭枢、白崇禧一起，成功争取原直系军阀赵恒惕属下第四师师长唐生智转向革命，唐生智部改编为国民革命军第八军，参加北伐战争。7月，国民革命军出师北伐。在北伐战争前夕，根据国民党中央的决定，湖北组织了以董必武为主席的特种委员会，搜集敌方的政治军事情报，扰乱敌人后方，策动敌军起义，配合北伐进军，至10月10日，武汉三镇全部攻克。
1927年1月3日，英帝国主义在汉口江汉关制造了震惊中外的一三惨案。董必武、刘伯垂等人组织武汉人民，举行反英游行示威，声讨英帝国主义的暴行，驱逐了英国巡捕。在武汉市民和各界团体强烈要求下，英国政府被迫宣布交还汉口英租界。
按照原定计划，北伐军攻克武汉后，广州的国民政府迁都武汉。董必武与宋庆龄、徐谦、陈友仁、宋子文、孙科等国民党左派及苏联顾问鲍罗廷一起举行会议，成立国民党中央执行委员、国民政府委员临时联席会议。董必武以国民党中央候补执行委员、湖北省党部代表的双重身份成为联席会议的成员，参与国民党中央一切重大方针、事项的决策。
可是，曾最先提出并几次催促迁都武汉的北伐军总司令蒋介石很快改变了主意，擅自决定国民党部和国民政府“暂驻南昌”，要求立即取消中央联席会议，挑起了“迁都”之争。董必武立即展开了一系列旗帜鲜明的斗争。1927年1月11日,董必武发出欢迎中央政府迁鄂的通电，接着，广泛发动各阶层人士及各政治团体集会，发表通电，反对蒋“迁都”南昌另立中央。董必武主持的《汉口民国日报》，每天以大字标题报道武汉党政军群各界要求定都武汉的呼声。在强大的公众舆论压力下，加上滞留在南昌的一些国民党员的争取，迁都之争以蒋介石的失败而告终。3月10日至17日，国民党二届三中全会在武汉召开。会议免去蒋介石的中央常委会主席、军事委员会主席、军人部长、中央军事政治学校校长等职，限制了其国民革命军总司令的权力。
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