第1章 影响蛋白质结晶的因素
作为生命活动的主要执行者，蛋白质在生命活动过程中发挥着不可替代的作用。蛋白质分子的生物学功能取决于其结构，因此，解析蛋白质分子的结构对理解生命活动过程十分重要，是生命科学研究中非常基础而又十分重要的工作。目前蛋白质结构测定的方法主要有三种，即X射线衍射技术、核磁共振技术和电子显微镜技术。迄今，蛋白质数据库(protein data bank，PDB)中，90%以上的蛋白质结构是通过X射线衍射技术解析的[1]。可见，X射线衍射技术是目前应用*广泛的蛋白质结构测定方法。此方法需要高质量的蛋白质晶体作为衍射对象，因此，获得衍射质量的蛋白质晶体是X射线衍射技术确定蛋白质结构的必要条件[2]。
根据结构基因组计划的统计数据，从高度纯化的蛋白质，到获得衍射质量即获得可解析结构的衍射数据的蛋白质晶体，成功率不足20%。该过程是从蛋白质表达到获得其结构的一系列流程中，成功率*低的环节之一。因此，获得高质量蛋白质晶体仍是结构生物学领域的瓶颈问题之一。
除了结构生物学领域对蛋白质晶体有强烈的需求外，在其他一些重要研究领域，蛋白质晶体也具有重要价值。例如，2017年的国际药物市场中，蛋白类药物已经异军突起，其市值已开始超越传统化学药物；销售排行排名前十的药物中，仅排名第5和第8的药物为传统化学药物，其他均为蛋白类药物。由此可见，蛋白类药物已成为药物市场引领性的发展方向。蛋白类药物的制造，需要高纯蛋白质的生产，而蛋白质结晶是获取高纯蛋白质的*佳手段之一，在药物市场受到越来越广泛的关注，通过结晶途径生产蛋白类药物已成为一种重要发展趋势。除蛋白类药物外，蛋白类化学试剂也需要高纯蛋白质的生产技术，蛋白质结晶均可提供重要手段。另外，在材料科学研究领域，蛋白质晶体作为材料的一种类型，具备特殊的有序结构框架，已成为研发新型材料的模板材料，有望在新型材料研发中发挥重要作用。可见，蛋白质结晶具有十分重要的价值。
结晶是一个复杂的物理化学过程，受多种因素的影响。McPherson[3]提出了影响蛋白质结晶的物理、化学和生物化学因素，并指出pH、盐和沉淀剂浓度等因素对其影响较大。相对而言，其他参数对蛋白质结晶影响较小，但也起着重要作用，如配位体或抑制剂的存在与否、盐或缓冲液浓度的变化、温度、去垢剂种类和浓度等。同时也包括一些非结晶溶液体系的因素，如声波、光波、电场、磁场、油、凝胶、逆扩散、振动等。
蛋白质结晶的影响因素虽然很多，但是可以归结为两类：①影响结晶成功率的因素；②影响晶体质量的因素。这两类因素，也是蛋白质结晶的关键。
本书根据前人研究成果，从物理因素、化学因素和生物化学因素三个方面综合分析梳理影响蛋白质结晶成功率和晶体质量的因素，以期为读者提供较为全面的内容。
1.1 物理因素
物理因素是一个较为宽泛的概念，包含一切可能的物理条件，如声、光、电、磁、热、力、辐射等。对蛋白质结晶而言，凡能够对蛋白质分子本身，或对分子之间相互作用产生影响的物理条件，均可能影响结晶过程。上述物理条件，均有望对蛋白质结晶过程产生影响。本小节对已有研究中影响蛋白质结晶的物理因素进行梳理，按声、光、电、磁、热(温度)、力(微重力、机械振动)、其他(固态界面、强迫对流、杂质等)等因素进行简述。
1. 声波
声波可以分为次声波、可闻声波和超声波。目前，已研究的影响蛋白质结晶的声波包括可闻声波和超声波。声波能够引起结晶溶液的振动，使结晶溶液温度升高，促进溶剂挥发，进而影响蛋白质结晶。超声波会产生较高的能量，其作用时间及照射点也会对结晶造成一定的影响，包括改变溶液过饱和度及亚稳区面积、缩短形核诱导期、促进晶核形成、控制晶体数量及尺寸、影响晶体晶型等。但是，超声波的能量较大，长时间作用于蛋白质结晶溶液可能会影响蛋白质分子的构型，进而影响其结晶过程。
Luft等[4]将超声波应用于蛋白质的结晶，超声波振动产生的较高能量使溶液中的聚四氟乙烯小球移动，将大晶体打碎为小晶体，然后将小晶体加入到过饱和度较低的蛋白质溶液中，在亚稳区实现高质量蛋白质晶体的生长。Nanev等[5]研究发现，在一定条件下进行超声处理可显著缩短溶菌酶的形核时间，促进蛋白质晶体的生长。结果表明，超声波促进溶菌酶晶核的形成，可能是因为打碎了一些已经形成的蛋白质聚集体并将其作为新的晶核中心，从而缩短了形核时间。除了超声环境外，可闻声波对蛋白质结晶也会产生影响。Zhang等[6]研究了不同声强级和频率的可闻声波对蛋白质结晶的影响。结果表明，蛋白质结晶成功率与声波频率呈现正相关，在约5000Hz声波频率的刺激下，蛋白质的结晶成功率*高。Guo等[7]研究了利用表面声波促进蛋白质结晶，发现该方法能显著提高蛋白质结晶成功率。
2. 光照
研究较多的影响蛋白质结晶的光照因素主要包括紫外光、可见光及飞秒激光，研究表明光照具备促进蛋白质结晶的能力。Adachi等[8]发现强烈的短脉冲激光照射可促进蛋白质结晶，据此提出了一种新的结晶技术，即激光照射生长技术。飞秒激光照射可使过饱和度较低的亚稳区达到局部过饱和，从而使晶体成核，在过饱和度较低的亚稳区生长出质量较好的晶体。同时，适当强度的飞秒激光照射蛋白质结晶溶液，不仅可以缩短蛋白质的结晶时间，还可以提高蛋白质的晶体质量。
Okutsu[9]研究了连续氙灯产生的弱紫外光对溶菌酶晶体形核的影响，发现紫外光照射蛋白质溶液的*佳时间为10～60s，在此范围内不仅可以促进蛋白质晶体的形核，同时也可以保证酶的活性。波长为400～700nm的可见光照射蛋白质结晶溶液，可使蛋白质结晶成功率提高25%以上。该方法优点在于，可见光对蛋白质分子构型无影响，不会使蛋白质变性，也不会影响溶液的温度。
3. 电场
蛋白质是典型的两性分子，因此其在电场中会受到电场力的作用，从而影响结晶过程。已有研究表明，电场对蛋白质的结晶具有积极的促进作用。用于蛋白质结晶的电场，根据使用的电源性质可分为交流电场和直流电场，也可根据电场施加方式分为内置电场和外置电场。
Hou等[10]研究了交流电场对蛋白质结晶的影响。结果表明，在大规模自发成核的条件下，适当调整交流电场可以使蛋白质分子脱溶质形成仅具少量成核位点的凝胶基质。去除交流电场后，凝胶基质转变为成核位点周围的晶体，形成高质量的晶体。Adela等[11]研究了2Hz的交流电与16.5T强度的磁场对溶菌酶晶体生长的影响。结果表明，在“呼吸波”交流电和16.5T强度的磁场作用下，能够获得较大尺寸的规则晶体。
Taleb等[12]研究了电场作用下溶菌酶的结晶。研究表明，电场使晶体的成核速率急剧降低，形成了较大尺寸的晶体。由于溶菌酶表面带正电，因此晶体在阴极附近生长。Eliano等[13]研究了交流电场对蛋白质结晶的影响。他们采用以Ti/Cu合金作为电极的阴极与阳极交叉排列的平行电极组，研究了不同电压和频率条件下溶菌酶的结晶。结果表明，在适当的电压和频率组合下可获得外形较好且质量较高的晶体。
4. 磁场
1981年，Rothgeb等[14]首次利用核磁共振仪产生的磁场对蛋白质结晶过程进行了研究。结果表明，亚铁血红蛋白质晶体产生了磁场定向。蛋白质晶体在磁场中生长时，受磁场强度和梯度两方面的共同作用。Lin等[15]研究了梯度磁场对蛋白质结晶的影响。结果表明，在低重力条件下得到的晶体具有更高的晶体质量和衍射分辨率。Yanagiya等[16]研究了均匀磁场对蛋白质结晶的影响，发现均匀磁场也能够明显改善晶体的质量。Yin等[17]成功地实现了强磁场条件下无容器悬浮的蛋白质结晶和溶解，发现悬浮无容器条件下晶体质量得到了明显提升。
Magay等[18]报道了盐浓度梯度结晶法与顺磁盐MnCl2和磁场的耦合效应，在磁场条件下使溶菌酶结晶，获得了具有光学完整性的直径大于10mm的单晶。Wakayama等[19]将磁力叠加在重力场上，研究其对溶菌酶晶体生长的影响。结果表明，当施加5%的磁力，蛋白质所受的磁力与重力同向时，晶体数量多于对照组；蛋白质所受的磁力与重力反向时，晶体数量少于对照组，但尺寸会显著增大。
总体上，关于磁场影响蛋白质结晶的研究表明，磁场本身对蛋白质晶体的质量多有正面促进作用。同时，如果利用梯度磁场实现模拟微重力或低重力，也可以在磁场作用下，进一步提升晶体质量。
5. 热
温度是蛋白质结晶过程中一个非常重要的因素，也是结晶必须考虑的环境条件。温度主要是通过改变结晶溶液的过饱和度而影响结晶。一般而言，不同的蛋白质具有不同的*适结晶温度或温度区间，因此寻找*适的结晶温度或温度区间对于提高蛋白质结晶成功率至关重要。
在蛋白质结晶研究领域，有大量的关于温度影响蛋白质结晶的报道。例如，Penkova等[20]通过控制温度在玻璃毛细管内形成不同的过饱和度梯度来寻找胰岛素蛋白的*佳结晶温度。Zhang等[21]提出了一种温度循环扫描的方法来提高蛋白质的结晶成功率。Landsberg等[22]提出了热筛选法，该方法允许温度(4～99℃)在12个范围内变化，通过监测16种不同蛋白质的结晶成功率来获得适合结晶的温度。研究结果表明，温度对蛋白质晶体尺寸的影响曲线呈抛物线型：4～20℃温度范围内，溶菌酶的晶体尺寸随着温度的升高逐渐增大；20～21.5℃为溶菌酶的*适结晶温度区间，此时晶体呈六边形；21.5℃以上，随着温度的升高，溶菌酶的晶体尺寸逐渐减小。总之，根据温度在结晶体系中的重要性可以预见，针对温度因素开展蛋白质结晶的工艺或机理研究，仍将是未来相当长时间内的一个主题。
6. 力
力学因素对蛋白质结晶过程也会产生明显的影响。力学因素对较大尺度的物质体系(如流体)运动将产生影响，进而对结晶过程产生影响。*常见的研究是微重力环境的利用，此外也有利用超重力条件及机械振动条件开展的研究工作。
关于微重力提升晶体质量的研究，从20世纪80年代开始至今，有大量的成果可以参考[23，24]。多数研究指出，空间微重力环境有利于提升蛋白质晶体质量。在微重力条件下，结晶溶液体系中的自然对流几乎消失，从而发生两方面的明显变化：一方面，对流消失将引起物质输运的明显变化。晶核形成后，将消耗周边的溶质，形成一个溶质缺乏区。由于对流的消失，溶质的输运将主要依靠扩散实现，从而使晶体生长在过饱和度较低的环境下进行，对晶体质量产生正面影响。另一方面，微重力条件下沉降也基本消失，从而使常见的晶体沉降导致晶体堆积引起的晶体质量变差的情况消失，有利于促进晶体质量的提升。
超重力对蛋白质结晶产生正面作用，但其机制与微重力不同。离心机可以实现超重力环境，在超重力环境下，结晶溶液底部容易实现较高的溶液浓度，从而增加获得晶体的机会[25]。某些条件下，由于过饱和度不足，难以实现结晶，在超重力作用下，有望促使蛋白质结晶。而一旦结晶开始，由于整体溶液浓度并不高，因此也可在较低过饱和度条件下实现晶体的生长，从而不仅能够提高结晶的成功率，同时也能提升晶体的质量。
机械振动也可以对结晶过程产生明显影响。已有研究证实，1～100Hz的机械振动能够使结晶液滴中的晶体数量减少[26]，并提高晶体的质量[27]。
7. 其他物理因素
1) 固态界面(形核剂)
晶体形核是结晶的第一步，非常关键。形核，往往通过两种途径实现：均质形核、固态界面形核。其中，均质形核一般指通过结晶溶液的浓度起伏和结构起伏实现形核的过程，而固态界面形核则是指蛋白质分子吸附在某个固态界面(形核剂表面)形成晶核的过程。由于形核需要克服能量势垒，因此为结晶提供一个界面，就可以降低体系的总自由能，从而降低形核势垒。因此，固态界面形核是比均质形核更容易实现结晶的途径，是*主要的蛋白质晶体形核方式。
固态界面形核，可分为两种情况：一是从籽晶上直接外延生长(
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