第1章 绪论
1.1 纳米材料及其对土壤生物的毒理效应
1.1.1 纳米材料定义
纳米材料简单定义是指颗粒三维粒径中，至少有一维尺寸在纳米尺度(1～100 nm)的材料。ISO定义纳米物体为一维、二维或三维外部维度处于纳米尺度的物体[1]。Science文章中广被接受的纳米材料定义为：任何有机的、无机的或混合的(有机金属)材料，由于其超微小的尺寸，通常在纳米尺度区域(从1纳米、几纳米到几十纳米)，而呈现出独特的化学、物理和/或电学特性[2]。纳米材料的定义仍是科学和政策中广泛讨论的话题，但一致认同尺寸小，表面积大，反应活性强于块体材料是纳米材料应满足的要求。根据来源的不同，纳米材料又可分为自然纳米材料、工程纳米材料、偶然纳米材料，其中工程纳米材料和偶然纳米材料合称为人为纳米材料[2]。
1.1.2 土壤中纳米材料的毒理效应
纳米毒理学是从与工作场所和一般环境以及消费者安全相关的成熟科学——颗粒毒理学发展而来的一个新领域[3，4]，是研究负面纳米生物效应的科学[5]。目前，更多的研究关注于大气中的纳米颗粒通过呼吸途径造成的肺毒性，但对于纳米颗粒在土壤中生物毒性研究仍处于起步阶段。纳米材料对土壤生物的影响主要包括对土壤微生物和酶活性、土壤植物、土壤动物的影响几个方面。
(1)纳米材料对土壤酶活性的影响
土壤酶主要位于土壤微生物、植物根系分泌物、动植物残体中，包括只能在细胞内发挥作用的与代谢中心相关的细胞内酶(例如糖酵解酶)和可以泌出胞外保持活性的细胞外酶[6]。土壤酶是土壤微生物学和生物化学的主要研究议题，也是评估土壤质量和土壤健康的重要指标。几种用于反映金属氧化物纳米材料影响的重要酶是氧化还原酶(如过氧化氢酶)、水解酶(如脲酶)和转化酶(如蔗糖酶)。研究指出，Zn和ZnO纳米颗粒会降低土壤中的脱氢酶、磷酸酶和β-葡糖苷酶活性，然而纳米Zn和ZnO对脱氢酶活性的抑制效应小于Zn2+[7]，并且ZnO纳米颗粒也会显著抑制土壤蛋白酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性[8]这些研究都认为离子释放是金属基纳米颗粒产生毒性的原因。但是对纳米银(AgNPs)的研究发现，AgNPs可以在受试浓度内(1μg/g、10μg/g、100μg/g和1000μg/g)对土壤外酶活性产生负影响，并且由于几乎没有Ag+溶解，因此抑制作用可推断是由 AgNPs本身引起的[9]。另一项研究未发现3.2～320μg/kg AgNPs对荧光发光酶的处理效应[10]。Asadishad等在农田土壤中添加1～100 mg/kg工程纳米颗粒并对土壤5种胞外营养循环酶进行了测定，发现纳米ZnO和CuO对酶活性无影响或正影响，TiO2则倾向于无影响或负影响，而 AgNPs在100 mg/kg水平抑制了酶活性[11]。由此可见，纳米材料的剂量和种类、酶的种类都是影响正向和负向反馈结果的因素。因此更全面的生物学信息将有助于纳米科技在农业中的可持续应用。
(2)纳米材料对土壤植物的影响
纳米材料对植物既存在有益的影响，也存在有害的影响。有研究表明碳纳米管可以穿透种皮提供水分运输通道，促进种子的萌发[12-14]。Servin等综述了工程纳米材料(金属、金属氧化物、碳等)在减轻植物病虫害、提供微量元素、提高作物产量方面的功效[15]。鉴于以上优点，纳米农业应运而生。但同时也有相当的研究和综述文章关注纳米材料潜在的植物毒性。目前，研究中纳米材料的植物毒性主要从植物生理(例如减少的生物量、根长、发芽率和植物蒸腾作用等)、细胞积累和细胞毒性、亚细胞转运和分子水平[例如活性氧(ROS)诱导和DNA损伤]等方面考虑[16]。研究表明 AgNPs以线性剂量反应关系抑制幼苗的根伸长。AgNPs的银离子释放不能完全解释这种植物毒性作用[17]。有趣的是，暴露于 AgNPs悬浮液的拟南芥中的银含量比 AgNO3高，并且在用 AgNPs取代 Ag+处理时观察到所谓的“褐色根尖”现象，表明 AgNPs可以被植物吸收，而 AgNPs及其团聚物的大小(20 nm、40 nm、80 nm)要比植物细胞壁的昀大孔径还大[17]，这表明可能存在一种特殊的摄取机制，即可能被胞间连丝(50 nm)捕获或细胞壁灵活地改变孔大小摄取颗粒到共质体[17]。Peng等使用微区 X射线荧光(μ-XRF)和微区 X射线吸收近边结构(μ-XANES)分析表明，CuO纳米颗粒可横向穿过根表皮、外皮和皮质，昀终到达内皮层。但无法轻易通过凯氏带[18]。Zhang等利用 STXM和XANES技术发现纳米 CeO2在黄瓜根部为 CeO2和CePO4形态，而转移到地上部为 CeO2和羧酸 Ce形态，还原性物质如抗坏血酸在转化中发挥了重要作用[19]。本实验室昀近在添加4%改性纳米炭黑土壤培养的印度芥菜根细胞中发现了黑色纳米颗粒[20]。纳米材料和陆生植物相互作用机理已被 Gardea-Torresdey和Rico团队很好地总结[21-23]，不再赘述。目前学界一致认为积累在植物细胞中的纳米材料的潜在毒性尚不确定，因此在纳米农业应用时应保持谨慎并加强监管。
(3)纳米材料对土壤动物的影响
纳米材料对土壤动物的毒理效应仅有零星报道。土壤中1 g/kg纳米零价铁对白符跳(Folsomia candida)和介形虫(Heterocypris incongruens)产生不利影响。土壤中添加超过3%的 MCB将在短期内对土壤线虫组成产生显著扰动。表1-1列举了近年来有关纳米材料对蚯蚓影响的实验室研究，暴露浓度基本在较高的 ppm水平，不同的纳米材料或多或少对蚯蚓的存活、繁殖、酶活性、细胞毒性、代谢及 DNA产生影响。
表1-1 纳米材料对蚯蚓影响的实验室研究汇总
1.2 影响纳米材料生物毒性的主要因素
1.2.1 纳米材料性质的影响
影响纳米材料毒性的性质有化学组分、尺寸、形状、表面化学、溶解度、晶型、缺陷、亲疏水性、团聚、粗糙度和孔隙度、价态和导态等[35，36]。以下介绍了四个主要性质的影响。
(1)化学组分
根据化学组分的不同，工程/人造纳米材料可分为纳米碳材料、纳米零价金属、纳米金属氧化物、纳米聚合物、纳米乳液、纳米黏土和半导体量子点等[1]。由于元素或分子可能会在纳米材料的环境过程中释放出来，因此纳米材料固有的化学组分不同，表现出的毒性也具有特异性。例如，金属基纳米材料和有机纳米材料的毒性不同，不同金属纳米材料之间毒性也具有差异。以酶活性抑制的差异为例，重金属离子更倾向与酶上的(—SH)结合，或取代酶活性中心的金属离子，改变其空间构象，使其失活[37]；而有机物往往与酶中的羟基等基团共价结合，导致不可逆性抑制[38]。因此，可以推断生物对不同化学组分的纳米材料具有不同的灵敏度和抗逆性。此外，由于亲疏水性和溶解度的差异，不同化学组分的纳米材料在土壤各相间的分布不同从而具有不同的生物有效性。
(2)形貌结构
纳米材料形状各异，如棒状、管状、球体、立方体等。国际标准化组织(ISO)将纳米材料分为三大类：纳米颗粒(三维尺寸都在1～100 nm之间)、纳米纤维(二维尺寸为1～100 nm)和纳米板(一维尺寸为1～100 nm)[39]。对于相同化学组分的纳米材料，其形貌主要影响与生物直接接触产生的物理损伤。纳米材料通过与细胞膜分子相互作用进入细胞，不同形貌纳米材料与细胞膜分子的相互作用方式和能量不同[36，40，41]。大部分纳米材料都可以通过内吞方式进入细胞，由于形貌的差异，需要克服的膜形变能量(弯曲能和伸缩能)有所差异，一般来说，棒状和圆柱状纳米材料比球形纳米材料被细胞膜包裹所需的热力学力更大，经历的时间更长[42，43]。另外除了内吞外，由于纳米维数的差异导致的跨膜方式和毒性不同。一维纳米材料可能由于更强的附着力和更细的接触面直接穿入细胞膜[图1-1(a)]。据报道，碳纳米管(CNTs)由于其针状形貌可以直接接触和穿透细胞的脂膜，导致细胞膜紊乱[44，45]，进而扰动线粒体和细胞核[46]。二维纳米材料若有宏观二维侧面就不能被内吞，则易于切割细胞膜和提取磷脂[图1-1(b)]。石墨烯(GO)纳米片或纳米墙的锋利边缘将直接损坏细胞膜[47]。研究表明，通过分子动力学模拟，石墨烯片不仅主动插入和切割细胞的脂膜，而且从细胞膜上抽提出大量磷脂分子，破坏细胞膜的完整性，导致细胞死亡[48]。零维纳米材料(三个维度均在纳米尺度)，如近球形 CB，如前所述大概率通过内吞途径进入细胞[图1-1(c)][43]。但当颗粒尺寸过大或粗糙时，颗粒部分包覆导致形变程度(附着力)超出膜的承受范围(磷脂分子间作用力)时，则会导致膜的破裂或重构[40]。
图1-1 不同形貌纳米材料-生物膜界面相互作用概念模型
(a)穿透；(b)切割；(c)内吞
(3)尺寸大小
一般来说，粒径越小，毒性越大。用不同粒径(15 nm、30 nm、55 nm)的 AgNPs颗粒处理细胞24 h后，更小粒径的银纳米颗粒会产生更高的 ROS和细胞凋亡水平[49]。而且线虫更易吸收小粒径的 AgNPs颗粒[50]。美国耶鲁大学 Menachem Elimelech研究团队利用大肠埃希菌实验证明由于相同长宽比条件下，SWCNT比 MWNT有更小的直径、更短的长度和更大的表面积，与细胞表面接触的概率和面积更大，更容易分配和穿过细胞壁，具有更大的细胞毒性[45]。
(4)表面性质
纳米材料不同的表面化学性质会使其与邻近分子产生不同的静电作用、氢键作用、亲疏水作用、π-π共轭作用，与空间构型有关的毒作用过程也会受到表面改性的显著影响。有研究表明，表面羟基化的水溶性富勒烯C60(OH)24比易团聚态的原始C60产生更少的超氧阴离子自由基，减轻了对两种人体细胞的危害[51]。还原石墨烯(RG)比含有 C—OH、C=O、O=C—OH等官能团的氧化石墨烯(GO)有更强的抗菌能力，这种对细菌细胞膜损伤的优越性主要归因于其更锋利边缘结构的直接作用和其与细菌膜之间更好的电荷转移性能，氧化损伤的作用是其次的[47]。相反地，有大量研究表明，官能团化纳米颗粒比原始颗粒的毒性更大[52-54]。高分子(PVP、PEG等)表面修饰或包覆常常用来提高纳米材料的溶液稳定性，减少团聚。但同时也可能因溶剂化作用、配体作用等，改变它们的生物有效性和毒性[55，56]。也有研究表明，PEI修饰的 MWCNTs对蚯蚓的摄入没有明显影响[33]，PVP和OA包覆不影响AgNPs在蚯蚓体内的生物积累和其对蚯蚓的繁殖毒性[28]。
1.2.2 共存污染物的影响
除了研究纳米材料本身的毒性外，它们与其他共存污染物的联合作用会对其毒理效应产生影响。当纳米材料应用于重金属污染土壤修复时，纳米材料与重金属通过吸附、键合、化学反应等彼此影响，产生不同于单一纳米材料或重金属的毒理效应。有研究发现，在水体中2 mg/L纳米TiO2就会加剧Cu2+对大型蚤(Daphnia magna)的毒效应，表现为LC50由111μg/L降低到42μg/L，纳米TiO2对Cu2+的吸附增加了生物对Cu2+的摄入和积累，而纳米 TiO2还有可能与Cu2+竞争金属硫蛋白结合位点，使其解毒能力下降[57]。但也有研究表明，当纳米TiO2与Cd离子同时存在时，纳米TiO2对Cd离子的吸附作用使水中游离态Cd离子浓度降低，Cd离子对铜绿微囊藻的毒性显著降低[58]。水中0.01 mg/L Cu2+可以增加黑头呆鱼(fathead minnow)对外径为8～15 nm和20～30 nm两种多壁碳纳米管的生物积累系数，前者由19.0 L/kg变为8.0 L/kg，后者由2.7 L/kg变为42.9 L/kg[59]。污染物在土壤中的迁移能力决定了污染物的生物有效性。在土壤中，有关纳米材料与有机污染物共迁移的研究已经展
展开
