第1章 杭州西溪湿地沉积物细菌的群落结构和多样性
1.1 引言
湿地是水陆交界处形成的独特的生态系统。湿地生态系统中，沉积物是由各种微生物参与的、物质和能量发生频繁交换的特殊生境（徐长君和张国发， 2009）。沉积物中微生物的多样性对整个水体系统有重要影响（何建瑜等， 2013）。与水体中的悬浮微生物比较，沉积物微生物往往在单位数量和功能多样性上更胜一筹（Klammer et al.，2002），因此对水体生态系统平衡的重要性也更大。目前，沉积物微生物正受到越来越多研究者的关注（任丽娟等， 2013）。Li等（2011）利用荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization， FISH）和变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术，研究了海底表层沉积物中细菌的群落结构，发现属于 β-变形菌纲（β-Proteobacteria）的氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的丰度达到了（1.87～3.53）×105个细胞 /g，其群落结构组成与沉积物的盐度、温度、呼吸作用和总有机碳（total organic carbon，TOC）等因子密切相关，可以作为海域沉积物硝化作用的间接指示因子。时玉等（2014）利用定量 PCR（quantitative PCR，qPCR）和 DGGE技术，对青藏高原淡水湖普莫雍错和盐水湖阿翁错湖底沉积物进行细菌多样性的比较研究，结果发现青藏高原淡水与盐水湖泊沉积物细菌丰度与群落结构具有明显的差异；同时，沉积物细菌群落结构在不同深度也表现出差异。
杭州西溪国家湿地公园位于杭州市区西部，是自然湿地在一千多年农渔耕作下形成的罕见的城中次生湿地，曾经的稻、桑（柿）、鱼、蚕的农业模式是西溪湿地的一大特色。近 20多年来，随着经济和社会的发展，西溪湿地的面积由原来的 60 km2萎缩到现在的不足 12 km2，并且因为人类活动的日趋频繁，湿地的生态系统也遭到了不同程度的破坏（陈久和， 2003）。在此背景下， 2003年正式启动了西溪湿地综合保护工程，到 2008年保护工程一期、二期、三期基本建成并投入使用。西溪湿地植物园是西溪国家湿地公园二期建设的一部分，其目标是通过恢复一定比例的湿地植物群落，将原来大面积的鱼塘 -基-渚湿地演变成典型的湿地景观，形成自然的湿生生态系统，这对于西溪湿地的保护和修复有着重要的实践意义。本章以西溪湿地植物园区域内不同水生植物生境下的表层沉积物为研究对象，通过 MiSeq高通量测序的方法，研究沉积物中细菌的群落特征和多样性，以期为丰富西溪湿地生态系统内涵，开发西溪湿地的微生物资源，进而为西溪湿地的保护和修复提供理论和实践依据。
1.2 材料与方法
1.2.1 沉积物样品
沉积物样品于 2014年 6月采自杭州西溪国家湿地公园保护区湿地植物园野外观测样地（120°4′18″E，130°16′26″N）。湿地植物园的群落构建遵循了优势种培育模式，即在大面积宽阔的水域大量种植一种或数种水生植物，发展大面积的优势群落。选择的水生植物主要包括：①挺水植物群落［蒲苇（Cortaderia selloana）、白茅（Imperata cylindrica）等］；②浮水植物群落［睡莲（Nymphaea tetragona）、凤眼蓝（Eichhornia crassipes）等］；
③沉水植物群落［金鱼藻（Ceratophyllum demersum）、狐尾藻（Myriophyllum verticillatum）等］；④湿生植物群落［美人蕉（Canna indica）、黄菖蒲（Iris pseudacorus）等］。以上述 4类不同水生植物生境下的表层沉积物（0～10 cm）为研究对象，每种类型的样品由采样点中心及周围共 5个点的土样混合而成，样品编号为 1～4号。采集后的样品迅速放入无菌保鲜袋中，–20℃保存。
1.2.2 土壤理化性质测定
沉积物 pH测定采用间歇水测定法，称取数克沉积物样品，离心，取上清液，用 pH计测定其 pH。总有机碳含量采用 Analytik multi N/C 3100分析仪测定；总氮含量采用EURO EA元素分析仪测定；总磷含量采用 H2SO4-HClO4双酸消煮 -钼锑抗比色法测定（赵亚杰等，2015）。
1.2.3 高通量测序及数据分析
1. MiSeq高通量测序
用 EZNA Soil DNA Kit（OMEGA公司）提取基因组 DNA，对 16S rRNA V3、V4区进行扩增，引物： 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）；806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）。PCR扩增反应体系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5×10–3 mol/L dNTP 2 μL，Forward Primer（5×10–6 mol/L）0.4 μL，Reverse Primer（5×10–6 mol/L）0.4 μL， FastPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng。反应条件： 94℃预变性 120 s，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s；28个循环。每个样品 3个重复，将同一样品的 PCR产物混合后用 2%琼脂糖凝胶电泳检测， AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，切胶回收 PCR产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。参照电泳初步定量结果，将 PCR产物用 QuantiFluor.-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行 Illumina MiSeq高通量测序（李靖宇等，2015）。
2. 测序数据优化处理
为了保证后续生物信息学分析的准确性，对测序数据进行质量控制。通过过滤读数尾部质量值 20以下的碱基，利用 Trimmomatic、FLASH等软件筛选拼接序列的重叠（overlap）区错配比率低于 0.2、编码（barcode）错配数为 0、*大引物错配数为 2的优化序列进行后续分析。
3. OTU聚类分析及分类学分析
利用 Usearch（vsesion 7.1）软件平台，在 97%的相似水平对所有序列进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）划分。为了得到每个 OTU对应的物种分类信息，采用 RDP法（Wang et al.，2007）（置信度阈值为 0.7）对 97%相似水平的 OTU代表序列进行分类学分析。比对数据库为 16S细菌数据库： Silva（Release115）。
4. 群落 α多样性分析
基于优化处理的 OTU及相关分析软件 Mothur（version v.1.30.1）绘制了各样品的稀释曲线，并在重取样的基础上计算了种群丰富度指数 Chao值和物种多样性指数 Shannon-Wiener指数。
5. 多样本相似度分析
利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样本间的距离，即根据 β多样性距离矩阵进行层次聚类（hierarchical clustering）分析，使用非加权组平均法 UPGMA构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。分析软件：利用 Qiime软件计算 β多样性距离矩阵。
1.3 结果与分析
1.3.1 沉积物理化性质
沉积物中的总有机碳、总氮和总磷等含量是反映营养状况和污染程度的双重指标。表 1-1结果显示， 4个沉积物样品的理化特性有较大的差异，其中总有机碳和总氮*高的是 1号挺水植物生境样品，其次是 4号湿生植物生境样品；而总磷*高的是 4号湿生植物生境样品，其次是 1号挺水植物生境样品。 2号浮水植物和 3号沉水植物生境样品无论是总有机碳、总氮还是总磷明显低于 1号挺水植物、 4号湿生植物生境样品。样品的 pH均偏酸性，其中 2号浮水植物生境样品的 pH为 5.17，酸性*强。
表 1-1 西溪湿地沉积物样品理化性质
1.3.2 沉积物样品主要细菌类群分布
采用 RDP法对 97%相似水平的 OTU代表序列进行分类学分析，在数据库中没有相应分类单元的序列，以 norank标记。结果表明，沉积物样品具有很高的细菌多样性。在门的水平有变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿菌门（Chlorobi）、螺旋菌门（Spirochaetae）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等 30门（数据未显示）。在属的水平上共鉴定有 252属（图 1-1，已将丰度极低的部分合并为其他在图中显示），其中丰度较高且所有样品均有分布的主要有铁杆菌属（Ferribacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、厌氧黏细菌属（Anaeromyxobacter）、硫杆菌属（Thiobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、螺旋体属（Spirochaeta）、硫碱螺旋菌属（Thioalkalispira）、硫针菌属（Sulfuritalea）、泉发菌属（Crenothrix）、互养菌属（Syntrophus）和假红育菌属（Pseudorhodoferax）。1号和 4号的优势类群为铁杆菌属，丰度分别为 8.29%和 12.30%；2号和 3号的优势类群是乳球菌属，丰度分别为 13.52%和 8.87%。有些细菌类群仅在特定的样品中出现，如 1号样品特有的菌群包括 Actibacter属、贝日阿托菌属（Beggiatoa）和 Ferruginibacter属等 6个属； 2号样品特有的菌群有 Ferritrophicum属、堆囊菌属（Sorangium）和新衣原体属（Neochlamydia）等 10个属； 3号样品特有的菌群只有蛭弧菌属（Bdellovibrio）；4号样品特有的菌群有甲基暖菌属（Methylocaldum）和 Propionivibrio属。这些特有的菌群通常丰度较低。此外，尚有未培养（uncultured）和未分类（unclassified）细菌类群，前者占比为 30%～50%，后者占比为 10%～20%。说明西溪湿地沉积物中可能蕴藏有较多的潜在新物种。
图1-1 各样品优势细菌群落结构（彩图请扫封底二维码）
1.3.3 沉积物样品细菌群落 α多样性
利用高通量测序技术，过滤掉低质量的序列后， 4个样品共获得有效序列 67 734条，根据编码（barcode）标签进行样品序列拆分，并对初始序列进行去冗余处理以获得 16S rDNA唯一读段（unique reads），在 97%相似度下将其聚类为用于物种分类的 OTU，统计各样品在不同 OTU中的丰度信息， 4个样品共产生 2181个 OTU，经优化处理后，得到平均长度为 441 bp的序列，其中片段长度 >400 bp的序列数占总序列数的 99.74%。各样品读数和 OTU数量如表 1-2所示。
表 1-2 不同样品细菌群落的多样性指数
采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表的数目
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