第1章 核酸分离提取技术
1.1 脱氧核糖核酸（DNA）的分离提取
1.1.1 实验目的
脱氧核糖核酸（ DNA）作为生命的遗传物质，其双螺旋结构的发现对生物学具有里程碑的意义，不仅使生命科学进入分子生物学的时代，而且使生物技术得到更好的发展完善。当今的生物学可以进行从一个基因到一个基因家族的研究，进一步到宏观的基因组学研究。 DNA提取在植物生物化学研究中至关重要，基因分离与功能研究、遗传转化体系建立研究、转基因研究、基因作用机理研究及分子标记等都以 DNA的提取为前提。因此，有效分离提取高质量的植物 DNA是植物基因工程研究的基础。
植物组织含有较多的次生代谢产物如酚类、萜类、色素和多糖，这些物质给 DNA的分离、提取与纯化带来较多的困难，影响了 DNA分析与基因研究的结果。在动植物 DNA的研究过程中，科研人员相继探索出十二烷基硫酸钠（ SDS）法、氯化铯法等 DNA分离方法，但存在成本高、污染大且效率低等缺点。在众多的 DNA提取方法中， CTAB法具有成本低、效率高、操作便捷等特点，逐渐成为植物 DNA提取的常用手段。本节以葡萄叶片为材料，以 CTAB法为例，通过介绍 DNA提取的原理与步骤，详细阐述 DNA的分离提取和纯化技术，其目的是了解 DNA分离提取的技术原理，掌握操作流程。
1.1.2 实验原理
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法的原理是首先裂解植物细胞，释放植物 DNA，进而利用有机溶剂进行多次抽提，使蛋白质、多糖等变性沉淀，色素等有机物保留在有机溶剂中，而 DNA保留在水相中，昀终分离得到较纯净的 DNA。不同的 DNA提取方法、提取效率不同。在琼脂糖凝胶电泳中根据 DNA条带的亮度和清晰度可判断 DNA的产量、质量及完整性。在植物 DNA的提取过程中， CTAB的作用主要有两点：①破坏植物细胞膜，将植物 DNA从细胞中释放到缓冲液中；②与多糖和蛋白质结合，使蛋白质变性，有利于 DNA与变性蛋白质及多糖的分离。通过这两个特性，达到提取和分离 DNA的目的。乙二胺四乙酸（ EDTA）是二价金属离子的螯合剂，可螯合溶液中的 Mg2＋、Ca2＋，抑制 DNase酶对 DNA的降解作用。 Tris-HCl是常用的缓冲溶液，可使得 DNA稳定存在于适宜 pH的缓冲环境中。聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）和 β-巯基乙醇可防止植物细胞中的酚类物质氧化成醌类物质，防止它们与 DNA不可逆地结合，干扰提取分离效果。氯仿∶异戊醇可以溶解溶液中的色素，使蛋白质进一步变性析出并与 DNA分离，其中异戊醇作为消泡剂，可以使有机相与水相充分混刀。在高盐溶液——乙酸钠溶液中，离子键切断 DNA与蛋白质等大分子的结合，而且乙酸钠溶液中的 Na＋可中和 DNA分子所带的负电荷，消除 DNA分子间的静电斥力，防止其他大分子化合物与 DNA的结合。乙醇携带的羟基可以与 DNA分子上的 H＋结合，使 DNA分子脱水，疏水基团裸露出来，促使 DNA析出。
1.1.3 实验用品
1．材料新鲜幼嫩的葡萄叶片。
2．仪器和用具研钵、水浴锅、2mL离心管、 15mL离心管、容量瓶、涡旋仪、离心机、电泳仪、凝胶成像仪、紫外分光光度计、冰箱、移液器等。
3．试剂
1）CTAB提取液：将 4g CTAB、16.364g NaCl、20mL 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）、8mL0.5mol/L EDTA加入约 70mL的 ddH2O中，定容至 200mL并高温灭菌。
2）20% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：取 20g PVP粉末用 ddH2O充分溶解，定容至 100mL并高压灭菌。
3）氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V）：96mL氯仿（三氯甲烷）加 4mL异戊醇混刀。
4）75% 乙醇（ V/V）：75mL无水乙醇与 25mL ddH2O混合。
5）Tris-HCl溶液（ 1mol/L，pH8.0）：将 31.528g Tris-HCl溶于 200mL ddH2O中，调节 pH为 8.0后高温灭菌。
6）EDTA溶液（ 0.5mol/L，pH8.0）：将 18.61g Na2EDTA 2H2O与 2g NaOH粉末溶于 100mL ddH2O中，调节 pH为 8.0。
7）1×TE溶液（ pH8.0）：取 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2mL，加 ddH2O定容至 100mL。
8）乙酸钠溶液（3mol/L，pH5.2）：取 408.1g的三水合乙酸钠溶解于约 800mL ddH2O中，用冰醋酸调节 pH至 5.2，并定容到 1L。高压灭菌后室温保存。
9）乙酸铵溶液（1mol/L，pH4.5）：乙酸铵 7.7g，加 50mL水溶解后，加冰醋酸调 pH至 4.5，需用冰醋酸约 6mL，用 ddH2O定容至 100mL。 10）5×TBE电泳缓冲液母液：取 54g Tris，27.5g硼酸（ boric acid），0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加水定容至 1000mL。工作液为 0.5×TBE，使用时用蒸馏水稀释 10倍。
11）其他试剂：无水乙醇、氯仿∶辛醇（ 24∶1）混合液、聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）、 RNase、β-巯基乙醇、 5mol/L NaCl、核酸染料、液氮、琼脂糖等。
1.1.4 操作步骤
1．植物 DNA的分离提取（ CTAB法）
方法一
1）预热 CTAB提取液（ 65℃水浴）：配制后的 CTAB提取液放置时间长会有晶体析出，可 65℃加热溶解。
2）取约0.1g新鲜幼嫩的葡萄叶片在研钵中用液氮快速研磨至粉末。
3）将粉末转移至2mL无菌离心管中，快速加入 750μL CTAB提取液、20μL β-巯基乙醇、100μL PVP溶液（20%）并涡旋振荡至充分混刀。
4）在 65℃水浴 30min，其间每隔 10min颠倒混刀一次。
5）加入与上清液等体积（约 700μL）的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），充分混刀。
6）12 000r/min下离心 10min，将上清液转移至新的 2mL无菌离心管中。
7）加入等体积（约700μL）的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），充分混刀。
8）12 000r/min下离心 10min，小心吸取上清液至新的 2mL无菌离心管中。
9）加入2倍体积的无水乙醇上下颠倒混刀，室温下静置 30min。 10）用吸头将白色絮状 DNA挑取至干净的 2mL无菌离心管中，加 1mL 75%乙醇清洗 DNA 2次。 11）将乙醇溶液倒掉，晾干，使乙醇彻底挥发，加入 200μL 1×TE充分溶解 DNA。方法二 为便于实验操作，可简化实验步骤，参照 Doyle（1987）的方法略加修改如下：
1）新鲜幼嫩的葡萄叶片 0.5g置于研钵中，加入 5mL液氮，研磨成细粉状，待解冻后加入 5mL CTAB提取液。研磨成均刀的混合液后，转入 15mL离心管中，置于 65℃水浴锅中水浴 30min。
2）取出离心管，置于室温下冷却；加入 50mg聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）和等体积的氯仿∶辛醇混合液（ 24∶1），摇刀后，在 8000r/min下离心 10min。
3）将上清液移入另一洁净的 15mL离心管中，加入 5mol/L NaCl 2mL后，再加入 2倍体积预冷的无水乙醇（ 0℃），轻轻混刀，置入－20℃冰箱中 1h或过夜。
4）挑出似棉絮状的小团，用乙酸钠/乙醇溶液（10mmol/L乙酸钠，76%乙醇）洗涤30min后，在 10mmol/L乙酸铵中洗涤 30s，提取的 DNA溶于 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］中备用。
5）DNA浓度用 1%琼脂糖凝胶电泳估测，电极缓冲液用 TBE［10.8g Tris（pH8.0），5.5g硼酸，0.5mol/L EDTA 4mL，加水稀释至 1000mL］溶液。
2．植物 DNA的检测
1）琼脂糖凝胶制备：称取适量琼脂糖，加入 0.5×TBE溶液，加热配制成 1%的琼脂糖凝胶并加入核酸染料如溴化乙锭（ EB）等，冷却凝固后转移至电泳槽。
2）取适量DNA样品，加入 10×上样缓冲液与 ddH2O配制至总体积 10μL，用移液器转移至凝胶点样孔。
3）电泳后在凝胶成像仪中进行观察，质量好的 DNA应在凝胶中呈现单一亮带（图 1-1A）。
4）取 2μL DNA样品，用紫外分光光度计测定 DNA浓度和质量，纯净的 DNA样品 OD260/OD230≥2且 OD260/OD280≈1.8。OD260/OD280＜1.8说明有蛋白质污染， OD260/OD280＞1.8说明有 RNA污染。
3．植物 DNA的纯化
1）粗提的 DNA在电泳检测时可以看到 DNA条带和降解不完全的 RNA（图 1-1A），加入 RNase，在 37℃下保持 30min即可去除样品中的 RNA（图 1-1B）。
图 1-1葡萄叶片基因组 DNA提取
A．RNase消化之前的 DNA样品；B．RNase消化之后的 DNA样品
2）给去除RNA的 DNA样品中加入 10%体积的 3mol/L乙酸钠，轻轻摇刀 10s左右。
3）给上述DNA样品加入 2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻摇刀后，静置或者放在－20℃冰箱里 1h或者过夜，将漂浮在冷乙醇里的似棉絮状的小团挑出，用预冷的无水乙醇反复洗涤 3次后，挑出棉絮状的小团，置于另一洁净的离心管里，侧壁使预冷的无水乙醇流出，用洁净的吸水纸吸去预冷的无水乙醇，待 5min左右，加入 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］，形成纯化的模板 DNA备用。
1.1.5 注意事项
1）尽量选用较幼嫩的植物组织，如植物的幼芽与幼叶。一是细胞中的核酸占据主导地位；二是细胞处于发育早期，可减少多糖、酚类、蛋白质等大分子物质的影响。
2）研磨时首先使用液氮速冻提取组织，保持绝对冷冻低温，使组织细胞里的 DNA固定，防止 DNA降解，使组织变硬，便于充分研磨，以保证 DNA的提取质量。
3）核酸染料EB有诱变剂作用，操作时应注意个人防护，及时收集用过的染料，防止污染环境。
4）氯仿∶异戊醇进行抽提时离心时间可长些，取上清时保持静置，不要触及下层；应用氯仿、 β-巯基乙醇等化学试剂时应在通风橱中进行，做好个人防护，防止污染环境。
5）整个流程操作应尽量轻柔，不要剧烈摇晃，防止 DNA断裂。
1.2 核糖核酸（RNA）的分离提取
1.2.1 实验目的
细胞中的总 RNA包括 mRNA、rRNA、tRNA和 sRNA，其中有 80%～85%的 rRNA， 15%～20%的 tRNA和 sRNA，1%～5%的 mRNA。分子生物学中研究基因表达、信号转导、基因调控和转录组分析等都需要从植物中分离出高纯度且未降解的 RNA。本实验的目的是掌握从园艺作物中提取、纯化核糖核酸（ RNA）的方法并测定 RNA量。
1.2.2 实验原理
实验室中常用的 RNA提取方法较多，主要包括苯酚法、强变性剂法、阴离子去污剂法、LiCl-尿素法等。这些方法的共同原理是先提取总核酸，然后再选择性地分离出 RNA。
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