第1章　生物电化学研究方法
　　1.1　引言
　　生物电化学的起源与电化学同步，都源于1786年意大利科学家Luigi Galvani（1737—1798）的青蛙解剖实验[1]。Galvani发现电刺激青蛙时，可使其腿收缩，但惊讶的是，青蛙腿的神经和肌肉同时与两种金属接触时也能使青蛙腿收缩。Galvani当时认为，观察到的电流源于青蛙脑部，通过神经传导给金属，然后传导给肌肉（图1.1）。他将这一发现写信给Alessandro Volta（1745—1827），开始Volta同意他的观点，但随后写信告诉他电不是来源于脑部，而是由于两种不同金属的接触。显然，Volta的理解更进了一步。后者根据电鱼的结构设计了一种称为Volta电堆的装置（图1.1），现在称为电池。在Werner von Siemens（1816—1892）发明电动机之前，Volta电堆是仅存在的电源。然而，Volta的金属接触理论也不能正确地解释实验现象。直到1835年，Michael Faraday（1791—1867）才正确地证明了电能来源于电池中的化学转换过程。1814年，George John Singer出版了一部名为Elements of Electricity and Electro-Chemistry的书，从此才有了电化学这个科学分支的名称。
　　生物电化学研究方法并不容易总结，我们只能根据自己的粗浅判断来进行提炼，目的是抛砖引玉，引起同行们的关注，并希望能给予批评指正。正如两位主编在前言中所论述的那样，生物电化学涉及面很广，相关研究可能需要分层次展开。针对单个生物大分子和生物活性小分子（离子）的检测，亚细胞和单细胞分析、活体组织分析等可能需要不同的研究范式和技术。基本上所有的电化学技术均已经应用于生物电化学的研究，由于篇幅的限制，再加上我们掌握的知识有限，不可能进行全面的介绍，只能简单地介绍一些基础的方法和比较新的技术。这些技术包括循环伏安法、安培法、超微电极技术、振动光谱技术、各种扫描探针技术、单分子结电化学和表面等离激元共振成像等。
　　1.2　重要的基本电化学技术
　　生物电化学探索中总是涉及各种各样的电极，有大电极、小电极和超微电极（ultramicroelectrode，UME）之分。可根据不同的研究对象来选择适当的电极，例如，体外检测生物活性分子（临床检测血糖和心肌梗死标志物等）时，可采用大电极；活体内或单细胞分析，可采用微米/纳米电极；同时检测生物活性分子和离子时，可采用杂化电极（如碳与液/液界面组成的微型杂化电极）。在同时检测多种不同物质时，还可采用阵列电极，如模拟狗鼻子的电子鼻。
　　循环伏安法是*常用的电化学技术，也是探索未知体系和各种生物分子*先采用的电化学技术，这是因为通过电位扫描几圈，就可大概知道该物质的氧化还原反应的可逆性行为、是否在电极上吸附等。通过仔细的探讨可得到反应机理的信息、求算一些热力学和动力学常数等。其衍生的一些技术，如微分脉冲伏安法（DPV）、方波伏安法（SWV）、溶出伏安法（stripping voltammetry）和吸附催化波等[2]可极大地提高循环伏安法的灵敏度和选择性。循环伏安法的基础理论见Bard和Faulkner的经典教科书[3]。
　　由于常规电极与超微电极（指至少一维小于25?m的电极，超微电极分为微米电极和纳米电极）大小不同，扩散场不同，得到的循环伏安图如图1.2所示。在常规电极上扩散是线性的，循环伏安图呈峰型；而对于超微电极，扩散场是球形或半球形，得到的循环伏安图是稳态曲线。在探讨反应机理方面大电极更具优势，在测量动力学参数方面超微电极更加常用。
　　另外一类电化学技术是计时安培法（chronoamperometry）或安培法（amperometry），广泛地应用于超微电极活体内物质的探测或单细胞分析。对于常规电极，根据Cottrell公式，即电流与时间的关系可知，电流很难达到稳态，影响准确测量；而对于超微电极，电流会很快达到稳态。因此，在神经细胞内或附近监控神经递质时，大多采用超微电极[4]。在脉冲电位刺激时，如果记录的是电荷与时间的关系，就称为计时库仑法。这类技术和上面提到的循环伏安法及衍生技术均被称为控制电位技术。
　　超微电极在探索细胞分泌与胞吐行为，以及神经科学中发挥着重要作用，如监测细胞间神经递质传递过程。神经递质传递过程几乎决定了神经系统的所有功能，如关节的运动、大脑中杏仁核控制情绪的激活、海马区记忆过程等。监测神经递质传递过程需要化学传感器具备如下的能力：其尺寸大小可在微米区域工作，响应时间在毫秒级，具有高的选择性和灵敏度（通常要求可检测nmol/L级）。神经元与其他细胞之间的通信主要是通过分泌小分子，分泌这些分子的主要方式是胞吐，该过程导致细胞内的化学物质被挤出到细胞外环境。通过超微电极的测量，可以提供胞吐的直接化学证据。*早开展这方面工作的是Wightman课题组，他们采用碳纤维微米电极（半径5 ?m）和快扫循环伏安法与计时安培法，研究了单个牛嗜铬细胞在外加化学物质刺激下释放儿茶酚胺[5]，释放过程是量子化的。随后，Neher等采用类似的研究方法，探讨了单细胞囊泡融合的动态过程，发现在一些胞吐过程的初始阶段，电流与时间曲线呈现出前“脚”的特征，这是由囊泡中的物质可以从初始形成的小孔扩散到外部所致[6，7]（图1.3）。程介克等[8]采用半径为50 nm的碳电极研究了单个PC12细胞中多巴胺的释放。相对于微米电极，纳米电极可以显著提高监测囊泡释放的空间分辨率（图1.4）。
　　1.3　基于振动光谱的生物电化学分析方法
　　1.3.1　振动光谱
　　分子可以量子化地吸收特定波长的光能，产生不同分子能态间的跃迁。因分子的组成和结构具有高度的特异性，可以根据分子光谱的形成机理对分子及其周围环境的特异性物理化学信息进行分析。其中，分子化学键的振动、转动能级与中红外波段（波长范围：2.5～25m）的光子能量高度匹配。利用与振动、转动能级相关的分子光谱研究分子信息的方法称为振动光谱法。
　　根据经典理论，对于振动光谱，当分子的化学键振动和入射光电磁场耦合时，其哈密顿算符可以表示为[9]
　　（1.1）
　　式中，为分子的偶极矩；E为入射的电磁场强度。其展开式前两项为
　　（1.2）
　　式中，为分子的永久偶极矩；为分子的极化率。与和相对应的光质作用即为分子的红外吸收和拉曼散射。
　　红外光谱和拉曼光谱是被研究*多的两种振动光谱。这两种光谱可以实现化学键特异性的光谱分辨，识别分子的结构信息，进而研究其功能信息，已被广泛应用于生物分析中。
　　1.3.2　红外光谱
　　红外光谱是一种广谱吸收光谱，其原理如图1.5所示。由式（1.2）可知，不同波长的红外光照射分子后，只有与分子固有偶极矩变化频率相同的光子才会被吸收，实现振动能级跃迁，形成分子的红外光谱[10]。因此，红外光谱具有很强的化学键特异性，又被称为“指纹光谱”，可以用来指认分子的官能团和结构（图1.6）。理论上，分子的振动吸收是量子化的过程，红外光谱的吸收强度可用朗伯-比尔定律表示。在气相分析中，根据不同波长下的分子吸收截面，可以利用线状的红外光谱特征实现定量分析。但在液相体系中，由于分子浓度较高，往往存在转动跃迁对能量的吸收，导致红外光谱的特征信号呈现带状。因此，液相红外光谱通常仅用来进行定性或半定量分析。
　　由于偶极矩变化仅存在于不对称的化学键振动中，因此并非所有的分子和化学键都具有红外活性。同时，由式（1.1）可知，只有当入射光电场方向与分子的偶极矩方向平行时，才能有效地产生红外吸收，这称为红外光谱的表面选律。通过调整入射光的偏振方向（s偏振：电场方向垂直于入射平面；p偏振：电场方向平行于入射平面），比较所测得的分子红外吸收信号特征，就可以通过红外选律特异性地研究界面的分子取向。当分子位于金属表面时，分子极化将会在金属表面产生镜像偶极。当分子的偶极矩与金属表面平行时，其镜像偶极会和分子偶极部分抵消，造成红外信号减弱；而当分子偶极矩垂直于金属表面时，其镜像偶极会有效增强分子偶极，使得红外信号增强。这种规律称为红外光谱的金属表面选律。利用金属表面选律，使用偏振光测量红外光谱，也可以获取金属表面的分子取向信息[11]。
　　1.3.3　增强红外光谱和增强红外光谱电化学
　　虽然使用红外光谱可以实现分子信息的特异性获取，但分子的红外吸收截面很小，通常在10?21 cm2数量级。在液相测试中，很难达到常规固体红外测试中较高的分子浓度，故实现高灵敏度（如界面单分子层级别）的红外光谱检测还需利用特殊的技术进行有效的信号增强。
　　由式（1.1）和式（1.2）可知，红外光谱的信号强度和分子所处位置的电磁场强度E以及化学键的偶极矩p呈正相关。因此，可以分别通过电磁场增强机制和化学增强机制对E和p进行调制，实现红外光谱的信号增强。电磁场增强机制是在入射光强度不变的前提下，通过构筑特异性的增强基底，提高分子所处位置的电磁场强度，实现红外信号的放大。通过该方法，目前已经可以实现数量级高达105的信号增强，检测灵敏度可以低至数百个分子。化学增强机制是通过分子-基底间电荷转移等机制，对化学键的偶极矩产生影响，进而增强红外光谱。这种方法对红外信号的增强有限，通常不超过两个数量级。
　　将红外光谱和电化学进行耦合，可以在外加电位下，实现对界面和体相分子的外场控制，进而通过动态、原位的红外光谱对电位相关的分子结构与功能进行分析，这对研究界面过程与机制具有重要的价值。为了实现红外光谱电化学研究，需要设计特殊的光路和电化学池以同时满足红外光谱和电化学检测的需求，通常要基于以下几方面考虑：①提高红外光谱的检测灵敏度，实现电极界面亚单层分子水平分析物的检测；②减弱液相环境中溶剂分子（如水分子）等对红外光吸收的背景信号；③构筑合适的电极界面满足电化学测试的需求，同时具有红外光谱测试的兼容性。
　　在现阶段的增强红外光谱电化学研究中，衰减全内反射表面增强红外光谱（ATR-SEIRAS）是使用*广泛的研究平台，其实验装置如图1.7（a）所示。红外光束通过高折射率和高透过率的光学棱镜，以大于光学临界角的角度入射，在棱镜/溶液界面发生全反射。此时，在界面的光疏介质溶液层中，会形成强度随界面距离增加呈指数式衰减的电磁场，称为衰减波。衰减波会和棱镜表面构建的粗糙金属

目录
丛书序
前言
第1章　生物电化学研究方法　1
1.1　引言　1
1.2　重要的基本电化学技术　2
1.3　基于振动光谱的生物电化学分析方法　4
1.3.1　振动光谱　4
1.3.2　红外光谱　5
1.3.3　增强红外光谱和增强红外光谱电化学　6
1.3.4　EC-ATR-SEIRAS联用平台的构建　7
1.3.5　红外光谱电化学应用于生物分析　8
1.3.6　时空分辨红外光谱电化学应用于生物分析　9
1.3.7　拉曼光谱和增强拉曼光谱　10
1.3.8　拉曼光谱电化学应用于生物分析　11
1.4　扫描探针技术　13
1.4.1　扫描电化学显微镜　13
1.4.2　扫描离子电导显微镜　17
1.5　基于单分子结技术的生物电化学分析方法　21
1.5.1　单分子结技术的基本原理　21
1.5.2　电子传输机理　23
1.5.3　单分子结的有效构筑方法　25
1.5.4　单分子结技术在生物电化学分析中的应用　27
1.6　基于表面等离激元共振技术的生物电化学成像分析方法　29
1.6.1　表面等离激元共振技术的基本原理　29
1.6.2　表面等离激元共振电化学成像技术　31
1.6.3　表面等离激元共振成像技术在生物电化学分析中的应用　35
参考文献　36
第2章　生物氧化与氧化磷酸化　39
2.1　引言　39
2.2　生物氧化　40
2.2.1　生物氧化的特点　40
2.2.2　体内物质氧化的方式　41
2.2.3　ATP的生成方式　43
2.3　电子传递链　44
2.3.1　呼吸链中的递氢体和递电子体　44
2.3.2　线粒体内膜中的电子传递复合体　46
2.3.3　呼吸链中电子传递体的排列顺序　47
2.3.4 胞液中NADH的氧化　49
2.4　氧化磷酸化　50
2.4.1　氧化磷酸化偶联部位　50
2.4.2　氧化磷酸化偶联机制　52
2.4.3　影响氧化磷酸化的因素　53
2.5　柠檬酸循环与脂肪酸分解中的生物氧化　55
2.5.1　柠檬酸循环通过氧化磷酸化生成ATP　55
2.5.2　脂肪酸的?-氧化　57
2.6 呼吸链中氧化还原蛋白质的电化学行为　59
2.6.1　细胞色素c的直接电化学　60
2.6.2　血红蛋白的直接电化学　61
2.6.3　其他血红素蛋白的直接电化学　63
参考文献　64
第3章　糖电化学　66
3.1　引言　66
3.2　糖氧化还原电化学　68
3.2.1　金属及其氧化物电极上的糖电化学　68
3.2.2　金属纳米材料修饰电极上的糖电化学　71
3.2.3　金属化合物或金属-非金属复合物修饰电极上的糖电化学　73
3.2.4　色谱/毛细管电泳中糖的电化学检测　74
3.3　催化型葡萄糖生物电化学装置　75
3.3.1　葡萄糖安培酶电极　75
3.3.2　葡萄糖燃料电池　78
3.4　糖类相关的亲和型生物电化学传感器　79
3.5　糖类相关的功能材料与电化学　83
3.5.1　几种聚糖与电化学　83
3.5.2　糖碳材料与电化学　85
3.6　总结与展望　86
参考文献　86
第4章　氨基酸电化学　93
4.1　引言　93
4.2　氨基酸的电化学活性　95
4.2.1　氨基酸的直接电化学氧化　95
4.2.2 氨基酸的催化电化学氧化　100
4.2.3 氨基酸的电化学活性衍生　102
4.3　氨基酸的电化学分析　103
4.3.1　氨基酸的非手性电化学分析　103
4.3.2 氨基酸的手性电化学分析　107
4.4 氨基酸衍生的电化学材料　110
4.4.1　氨基酸分子功能化电化学材料　110
4.4.2 氨基酸辅助合成电化学材料　113
4.4.3　氨基酸的电化学聚合　114
参考文献　114
第5章　蛋白质电化学与酶催化　118
5.1　引言　118
5.2　蛋白质电化学研究历史　118
5.3 蛋白质电化学研究基础　121
5.3.1 电化学分析技术以及相关理论　121
5.3.2　电化学研究常用蛋白质　123
5.4　基于蛋白膜伏安法的蛋白质电化学及酶催化研究　126
5.4.1　基于传统材料的蛋白膜伏安法　126
5.4.2　基于纳米材料的蛋白膜伏安法　131
5.5　总结与展望　137
参考文献　139
第6章　核苷酸与DNA电化学　144
6.1　引言　144
6.2　核酸的电氧化与还原　144
6.2.1　核酸的结构与组成　144
6.2.2　核酸的基本电化学行为　146
6.2.3　核酸与电极表面的相互作用　149
6.2.4　核酸的电化学分析　149
6.3　DNA表面电化学　150
6.3.1　DNA在电极表面上的固定化　151
6.3.2　DNA与其他分子相互作用研究　155
6.4　电化学DNA传感器　157
6.5 基体表面寡核苷酸探针的表面分析　159
参考文献　162
第7章　卟啉电化学　164
7.1　引言　164
7.2　液/液界面上金属卟啉电子转移过程的研究　166
7.2.1　液/液界面电化学基础　166
7.2.2　液/液界面电化学的发展　166
7.2.3　液/液界面电子转移反应的研究方法　166
7.2.4　金属卟啉的电子转移反应　167
7.2.5　不同取代基卟啉在模拟生物膜上的电子转移过程　169
7.3　卟啉在电致化学发光方面的研究　173
7.3.1　电化学发光法的基本原理　173
7.3.2 电化学发光法特点　175
7.3.3　卟啉的电化学发光体系　175
7.4　卟啉的光电生物传感　180
7.4.1　基于卟啉纳米材料复合物的电化学生物传感器　181
7.4.2　卟啉纳米复合材料的光电化学生物传感器　181
7.5　卟啉的光敏和光导材料　183
7.5.1　卟啉的光敏化材料　183
7.5.2　卟啉模型的研究与调控　183
7.5.3　卟啉界面的调控　184
7.5.4　钴卟啉的催化中心　185
7.5.5　卟啉的太阳能染料敏化电池材料　185
7.6　卟啉核壳结构纳米材料　187
7.6.1 卟啉核的特性　187
7.6.2 卟啉核的应用　187
7.7　总结与展望　188
参考文献　189
第8章　辅酶与激素电化学　194
8.1　引言　194
8.2　辅酶电化学　195
8.2.1　辅酶的分类　195
8.2.2 辅酶的电化学研究进展　198
8.3　激素电化学　209
8.3.1　激素的分类　209
8.3.2　激素的作用特点　212
8.3.3　激素的电化学研究进展　213
8.4　总结与展望　222
参考文献　223
第9章　生物分子作用与电化学　229
9.1　引言　229
9.2　活性小分子与核酸相互作用的电化学研究　230
9.2.1 金属配合物与DNA相互作用及生物传感应用　232
9.2.2　有机药物小分子与DNA相互作用　236
9.2.3　有机染料小分子与DNA相互作用　238
9.2.4　小分子与RNA相互作用　238
9.3　小分子与蛋白质相互作用的电化学研究　239
9.3.1　药物小分子与蛋白质相互作用　240
9.3.2　染料小分子与蛋白质相互作用　241
9.3.3　金属离子和金属配合物与蛋白质相互作用　243
9.4 核酸与蛋白质相互作用　244
9.5　核酸适配体对蛋白质的特异性识别　245
9.6 纳米材料修饰电极上蛋白质与其他分子相互作用　247
9.7　总结与展望　248
参考文献　249
第10章　生物膜电化学与生物界面模拟　255
10.1　引言　255
10.2　生物膜简介　255
10.2.1　生物膜结构　255
10.2.2　生物膜组成　256
10.2.3　生物膜的电性质　258
10.3　生物膜的模拟与表征　259
10.4　生物膜电化学分析原理　262
10.4.1　金属电极支撑仿生膜/溶液界面结构　262
10.4.2　红外光谱电化学技术　264
10.4.3　电化学-二次谐波成像　266
10.5　生物膜的电化学研究　268
10.6　生物膜相互作用电化学研究　277
10.7　总结与展望　283
参考文献　284
第11章　电化学生物传感器　286
11.1　电极材料　286
11.1.1　金属电极　286
11.1.2　碳电极　288
11.1.3　酶电极　290
11.1.4　微生物电极　290
11.2　分子识别及检测应用　291
11.2.1　检测小分子物质　291
11.2.2　检测核酸　293
11.2.3　检测病原体　295
11.3　电化学活体检测　297
11.3.1　双通道比率测定应用于鼠脑中物质的选择性检测　298
11.3.2　单电极比率电化学传感器实现活体脑内物质的精确测定　300
11.3.3　活体分析中两种物质的双信号输出　302
11.4　总结与展望　304
参考文献　304
第12章　纳米生物电化学　309
12.1　引言　309
12.2　构建电化学生物传感器的常见纳米材料　310
12.2.1　零维纳米材料　311
12.2.2　一维纳米材料　312
12.2.3　二维纳米材料　313
12.2.4　三维纳米材料　315
12.3　纳米材料在电化学生物传感中的应用　316
12.3.1　核酸分析　316
12.3.2　免疫测定　320
12.3.3　酶分析　323
12.3.4　细胞检测　324
12.3.5　生物小分子和离子的检测　327
12.4　总结与展望　329
参考文献　329
第13章　生物电化学成像　334
13.1　引言　334
13.2　扫描探针电化学生物成像　334
13.2.1　扫描电化学显微镜　334
13.2.2　扫描离子电导显微镜　343
13.3　光谱电化学生物成像　347
13.3.1　分子光谱电化学　347
13.3.2　表面等离子体共振电化学　349
13.3.3　暗场散射电化学　352
13.3.4　光学干涉电化学　354
13.4　电化学发光生物成像　355
13.4.1　基本原理　355
13.4.2　电化学发光成像仪器　358
13.4.3　生物成像分析　358
13.5　总结与展望　368
参考文献　369
第14章　细胞电化学　374
14.1　引言　374
14.2　细胞电化学传感器构建　375
14.2.1　电极材料和形貌简介　375
14.2.2　高灵敏度传感界面构建　376
14.2.3　高选择性传感界面构建　378
1