第一篇预防兽医学实验基本操作
第一章兽医微生物学实验基本操作
第一节实验常用物品的准备
微生物实验过程中使用的物品有很多，其中以玻璃器皿居多，如平皿、试管、烧杯、锥形瓶、移液管、载玻片等，其一般选取耐高热灭菌的玻璃器皿，且以中性玻璃为宜。玻璃器皿使用前必须经清洁、干燥和无菌处理（染色用的载玻片和配制溶液的器皿除外）。此外，在灭菌处理时，对各种器皿进行包扎，不仅能防止灭菌时冷凝水直接沾湿棉塞影响后续操作，还可在一定时限内防止污染，延长其存放时间。
一、玻璃器皿的处理
微生物学实验对器材的清洁程度有较高的要求，各种器材不但要达到生物学清洁，还需达到化学清洁。器材如不能达到生物学清洁，则常常发生各种污染，导致结果错误。若不能达到化学清洁，则常可影响培养基的 pH，甚至某些化学物质的存在可抑制微生物的生长，也可影响血清学反应的结果。
1．新购置的玻璃器皿未使用的新玻璃器皿因含有游离碱，一般在2%的盐酸溶液中浸泡数小时后再用清水洗净，也可在洗衣粉水中煮30～60min，取出用清水洗净。
2．使用过的玻璃器皿微生物和传染病实验中，使用过的玻璃器皿常带有病原微生物，需先经过灭菌处理后方可进行洗涤。经121℃高压蒸汽灭菌20min后，趁热倒去内容物，再用洗衣粉水刷洗干净。
3．带油污玻的璃器皿先将倒空的玻璃器皿用10%的氢氧化钠浸泡半小时或放在5%的碳酸钠溶液内煮两次，去掉油污，再用洗衣粉和热水刷洗，以水在内壁均刀分布成一薄层而不出现水珠作为油垢除尽的标准。
经上述处理的玻璃器皿，可满足一般实验使用。少数实验对玻璃器皿清洁度要求较高，上述操作后，还应用蒸馏水淋洗2～3次。要求更高的尚需超纯水淋洗然后烘干备用。
二、玻璃器皿的包扎
1．锥形瓶的包扎锥形瓶加上合适的棉塞或透气胶塞，在棉塞外用包扎纸（报纸或牛皮纸）包住，用线绳打上活抽绳结。所有瓶口的包扎均可采用此法。
2．试管的包扎试管塞上合适的棉塞（透气胶塞），用线绳包扎成捆后在棉塞外用包扎纸（报纸或牛皮纸）包住，再用线绳打上活抽绳结。
3．平皿的包扎
将5～10副平皿叠在一起，用报纸滚卷包裹，边滚卷边折叠两边的报纸，成圆筒状后，将两端的报纸折叠收口，或直接将平皿装入不锈钢或铜制平皿筒内，盖上筒盖后灭菌处理。
4．移液管的包扎先在移液管的手握端口处塞上适量棉花，松紧要合适，既可吹
吸时通气流畅又可阻拦杂菌入内，筒装或单支纸包后灭菌处理。
（1）筒装将多支端口塞好棉花的移液管装入铜制或玻璃制的圆筒中，移液管尖端朝筒内，筒底垫几层纱布，防止移液管尖端破碎，盖好筒盖。
（2）单支纸包将报纸裁成宽4～5cm的纸条，平铺于桌面上，将移液管的尖端放在纸条的左端，移液管与纸条约呈30°（夹角太小，纸条容易松开，夹角太大，则纸条长度不够），然后滚卷移液管，将前端报纸折叠封口，继续滚卷，将纸条呈螺旋状包裹在移液管外面，昀后将包卷多余的纸筒打结。
三、其他物品的准备
1．棉塞的制作
1）按试管口或锥形瓶的口径大小取适量棉花，使成形后的棉塞大小适合管口。
2）将棉花铺成长方形，中间厚，边缘薄。然后从一端开始卷，边卷边将边缘的棉花内收，卷紧成圆柱形，中间硬实。成形的棉塞可在瓶（管）口调试，直至合适。一般将成形棉塞的50%～60%塞入瓶（管）口内，松紧适宜。
3）取适当大小的纱布，将制作好的棉塞包裹，用线绳在一端扎紧，剪去多余的纱布和线绳。制作的棉塞可多次重复利用。
2．酒精棉球的制作先将棉花顺着纤维方向撕开至蓬松，左手轻握拳，取适量棉花从虎口处不断填塞至手心压实。将做好的棉球装在瓶中，倒入75%的乙醇，使棉球浸湿即可。
第二节微生物实验常用仪器的使用及注意事项
随着新技术的不断应用，微生物实验的仪器种类也在不断增加，个别仪器需经过高温高压。一旦不按规定操作，机器出现故障或损坏会造成很大的损失，直接影响教学科研工作，严重时还会造成人员伤亡。因此，熟练掌握微生物实验常用仪器的使用非常重要，故对实验室常用仪器的使用方法和注意事项予以介绍。
一、高压蒸汽灭菌器
高压蒸汽灭菌器主要由灭菌室、控制系统、过压保护装置等组成。灭菌室为一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。灭菌器内装有带孔的金属隔板，用以放置待灭菌物品。灭菌器外层为厚的金属板，其上有厚金属盖，盖旁有螺栓，借以扣紧金属盖，金属盖与锅体之间为密封圈，使蒸汽不能外逸。高压蒸汽灭菌器盖上装有温度计、压力表、排气阀和安全阀，以指示灭菌器内部的温度、压力及调节灭菌器内蒸汽压力。
灭菌器的工作原理是高温饱和水蒸气在一定时间内可使微生物的蛋白质变性，从而导致微生物死亡，达到对耐湿耐热物品灭菌的目的。
密闭的灭菌器内蒸汽不能外逸，随着压力不断上升，水的沸点也会不断提高，从而使锅内温度也随之增加，在0.1MPa压力下锅内温度可达121℃。在此蒸汽温度下维持20～30min可以杀死包括细菌芽孢和霉菌孢子在内的所有微生物。
灭菌器内蒸汽压力与锅内温度的关系见表1-1。
表1-1不同蒸汽压力所能达到的温度
1．操作方法
（1）加水打开高压蒸汽灭菌器盖，加水到合适刻度（手提式灭菌器加水到与支架圈平行处即可）。
（2）装料将待灭菌物品放于灭菌室的隔板上，物品摆放时注意彼此间留有一定空隙，使蒸汽在容器内能够流通到达每个物品的各部位，以免形成蒸汽死角。物品不要紧靠灭菌室壁，防止冷凝水进入灭菌物品。
（3）密封将锅盖上与排气孔相连的金属软管插入装料桶的排气槽内，使罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均刀旋转拧紧螺栓，使锅体密闭。
（4）加热打开排气口（放气阀）开始加热，排气5～10min后（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气排尽，关闭放气阀。温度随蒸汽压力增高而上升。待压力逐渐上升至其对应的温度为所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，到达规定时间，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
（5）降压、取料待压力表指针自然降至“0”位后，打开放气阀，松动螺栓，开盖。立即取出灭菌物品，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或被灭菌物品，增加染菌的概率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆放，灭菌后的空平皿、试管等要烘干或晾干。
（6）清理灭菌完毕后，倒出锅内剩余水，保持锅内干燥。若连续使用则需每次补足水量。
2．注意事项高压蒸汽灭菌技术的关键是在压力上升之前先排除锅内的冷空气。若锅内存有滞留的冷空气，压力表虽能达到指定压力但锅内温度却达不到相应的温度，灭菌效果不好。
灭菌时操作者不能离开现场，要严格控制热源并维持灭菌时的压力。压力过高不仅会使培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸。灭菌完毕后要自然冷却，切忌用凉水浇灭菌锅来降温。压力降至“0”位前不能开盖，以免培养基沸腾喷出。
定期检查灭菌效果，常用的方法是将硫黄粉末（熔点为115℃）或苯甲酸（熔点为120℃）置于试管内，然后进行灭菌，如上述物质熔化，则说明高压蒸汽灭菌器内的温度达到了要求，灭菌效果可靠。也可将检测灭菌器效果的胶纸（其上有温度敏感指示剂）贴于待灭菌的物品外包装上，如胶纸上指示剂变色，亦说明灭菌效果可靠。
二、电热鼓风干燥箱（干烤箱、烘箱）
电热鼓风干燥箱采用电加热的方式，通过循环风机吹出热风，利用高温干热空气杀死微生物，从而达到灭菌的目的。
该法适用于耐高温的玻璃和金属制品及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须保持长时间高温作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。
1．操作方法
（1）装料将待灭菌物品放入烘箱的搁板上，摆放不能过挤，要留有间隙，不能紧靠箱壁，以保证热空气流通，温度均刀。
（2）升温接通电源，打开开关，设置好灭菌温度及维持时间，按启动键开始工作。让温度升至设定温度。
（3）维持恒温在设定温度维持相应时间。
（4）降温灭菌完毕，切断电源，让其自然降温。
（5）取料待箱内温度降至60℃以下，可开箱取出物品。需避免烫伤等事故。
2．注意事项灭菌温度不要超过180℃，否则棉花、包扎纸等将被烧焦。干热灭菌过程中温度不能上升或下降过急。温度达到60℃以上时，不能随意打开干燥箱门。
灭菌后必须等箱内温度下降至60℃以下方可打开箱门，否则冷空气突然进入，玻璃器材极易破裂，且有引起纸和棉花起火的危险。另外，箱内的热空气逸出，易造成操作者皮肤灼伤。
三、冰箱（冰柜）
微生物实验室冰箱（冰柜）常用于菌种、酶、各种样本、核酸及一些重要的生物和化学试剂等的保藏。根据制冷温度和用途分为普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱等。
1．普通冰箱普通冰箱冷藏室温度一般为4～6℃，冷冻室为－20～0℃。冰箱均有温控器，可根据需求自行调节。常存放培养基、细菌培养物及需要2～8℃保存的物品，需定期整理，保持冰箱的清洁干燥。
2．低温冰箱低温冰箱温控一般在－40～－20℃。适宜存放血清、含毒材料、菌
种等。
3．超低温冰箱超低温冰箱温控可达－70℃以下，适用于存放毒种、病毒材料等。
夏季室内温度高时要特别注意通风，专人管理，定期清理。
四、离心机
离心机就是利用转子高速旋转时产生的强大离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，从而把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。随着科学技术的不断发展，离心机的功能不断扩大，种类也越来越多，离心容量从1mL/管至500mL/管。
微生物实验室常用到的离心机有以下几种。①普通离心机，转速可达4000～8000r/min，常用于离心沉降血细胞、细菌、瘤细胞澄清液体和提取免疫球蛋白等。②高速离心机，转速可达10000～15000r/min，常用于核酸的提取、微量样品的分析及少量含菌、含毒材料的沉淀澄清等。③超速离心机，转速可达25000～50000r/min，用于分离细胞和细菌，纯化和分离病毒、 RNA、DNA、质粒和蛋白质等生物大分子。④冷冻离心机，即兼有离心和冷冻功能的离心机。它具有冷冻系统，因此可以精确地控制离心室的温度，不但可以用来提取对温度要求严格的生物试剂，还可以提高离心效率。冷冻离心机被广泛应用于生命科学的研究领域，是分子生物学、分子化学、临床医学、微生物、病毒等实验和科学研究中不可缺少的重要工具。冷冻离心机可分为低速冷冻离心机、高速冷冻离心机、超速分析冷冻离心机和制备两用冷冻离心机等多种型号。
离心机工作时高速运转，使用时要注意安全，必须做到以下几点。
1．离心机的放置离心机使用时要放置在平稳、坚固的台面上，利用其底座安装的橡胶吸脚，借助于大气压力及仪器本身的重量，紧贴于台面；大容量普通离心机和高速冷冻离心机要安放在宽阔稳定的实验台或坚实的地面上，水平放置。超速离心机重达数百公斤，只宜放在平整坚实的地面上并有防尘、防潮措施，以使离心室达到一定的真空度，正常运行。离心机工作前，应将负荷平衡，重量误差越小越好，否则会引起剧烈振动，损坏离心转头及转轴。
2．离心机的启动与运行离心机内的分离支架必须在安置离心管后运转，严禁空架运转。离心机启动时，应检查离心机转速值旋钮是否放在低档位，数显式离心机应在通电后运行前确认离心速度值归零，启动后再逐步调节到所需要的数值。离心结束后，须将旋钮调至低档位。在高转速档位或高值档禁止直接启动。选择合适的转头，控制转头的转
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