绪论
医学是人类在同疾病斗争过程中，随着对机体的生理、疾病机制与病理特征的认识而逐渐发展起来的，技术与工具的发明和改进是促进医学水平不断提高的关键推动力。历经400多年近现代医学的发展，一些开创性基础实验研究与发明填补了医学学科的空白：解剖实验提出血液循环动力理论，继而建立了病理解剖学、实验生理学；显微镜的出现与应用发展了组织学、细胞学、细胞病理学；化学家将生命现象解释为化学变化；化学提取技术促进了药理学的建立；以进化论、细胞学说、能量守恒与转化定律为代表的自然科学三大发现有力地推进了医学科学的发展，为现代基础医学与临床医学奠定了基础。
20世纪40年代，第三次科技革命极大地推动了科学技术与医学的紧密结合，先进技术的融入促进了现代医学基础理论体系和临床诊疗策略的突破性发展。例如，化学合成药物的开创与抗生素的发现带动了药物治疗学的飞跃；分子生物学的诞生与发展推动了基础医学从细胞水平到分子水平更先进、更精确的研究，启动了分子诊断与基因治疗；人类基因组学及蛋白质组学更全面、深入地解析功能基因、疾病基因以及疾病分子机制；基因工程技术生产的生物制剂与药物变革了医学研究和药物疗法等，这些均说明开辟现代医学的新局面离不开科学研究技术的进步与应用。
第一节 医学基础研究技术的主要内容
随着现代医学的不断发展，更明确、精细地划分了基础医学和临床医学各学科。基础医学是研究人的生命和疾病的现象与本质及其变化规律的基础研究性学科，是临床医学的理论基石。基础医学以研究生命体的形态和功能特征为主，为临床医学提供人体正常和疾病状态下的形态结构、功能活动及其机制，引起疾病的因素及其机制，以及药物在人体的作用机制等研究成果。基础医学的实践性很强，各学科新技术新方法的不断涌现，促使医学基础研究更加深入，能够更全面地揭示疾病的机制，更好地服务于临床诊疗实践。因此，本教材按照不同学科的特点，重点从功能学研究和形态学研究两方面介绍常用并不断发展的医学基础研究技术与方法。
基础医学中的生理学、病理生理学、药理学、免疫学、生物化学与分子生物学等，是研究机体功能活动规律的实验性学科。各学科的理论来自整体、组织、细胞和分子等不同层面的实验性研究成果。通常利用在体（in vivo）实验和离体（in vitro）实验的系列技术方法研究正常和病理状况下机体功能活动、生理效应及其机制。
（一）整体水平研究技术与方法
机体的功能学研究主要是在动物模型上进行在体实验或离体实验，研究实验因素对机体器官、组织的功能活性和物质代谢等的影响，以及药物的作用机制等。根据不同组织器官的功能特点进行解剖学以及功能活性的观察，如观察交感神经对心脏活动的影响，可以在改变神经刺激状态下利用超声心动图、血流动力学测定、心室有效不应期测定、心室颤动阈值测量等评估心功能、心率及心脏电生理的变化。
（二）细胞水平研究技术与方法
细胞水平的功能性研究是指观察各种细胞组成成分的理化性质与细胞细微结构功能变化的关系，以阐明正常、疾病和药物处理下细胞生命活动的变化规律。
早期的细胞学研究主要是应用固定和染色技术，在显微镜下进行观察研究，20世纪中期后，采用细胞分离和细胞培养技术、结合分子生物学技术、流式细胞仪、同位素标记技术等开始对细胞的生长、增殖、代谢、凋亡等功能状态进行研究。以细胞杂交技术、细胞融合技术、胚胎干细胞技术、核移植技术为代表的细胞工程也是当今基础研究的热点领域。
（三）分子水平研究技术与方法
随着医学技术的进步，医学认知从细胞水平推进到分子水平，分子医学利用分子生物学和生物工程技术，研究正常及疾病状态下生物大分子结构与功能、物质代谢及其调节、基因表达与调控等，代表当今极为前沿的医学研究领域。
分子生物学技术主要包括核酸/蛋白质的分离纯化技术、核酸分子杂交技术、聚合酶链反应（PCR）技术、蛋白质印迹法（Western blotting）、脱氧核糖核酸（DNA）测序、生物芯片、蛋白质结构分析及生物大分子相互作用分析技术等，免疫组织化学也是检测蛋白质表达的一种定位与定量方法。基因操作是分子生物学技术的核心，DNA重组技术可进行目的基因克隆、定点突变以及基因打靶动物构建，开展基因功能及调控的研究，基因工程技术使外源表达蛋白的研究与应用有了可能。基因编辑技术以及基因组学、转录组学、蛋白质组学技术也成为当今分子医学的前沿基础研究技术。
二、形态学研究技术与方法
基础医学中研究生命体形态学特征的主要学科有人体解剖学、组织学与胚胎学、病理学、细胞生物学等。形态学研究是观察性的研究，包括大体形态和显微形态观察，主要是在大体和微观的层面对观察的结果进行定性、定位和定量描述以及对比分析。
（一）大体形态研究方法
大体形态观察是依赖肉眼对人体形态结构进行观察，包括人体解剖学及病理学等学科的基本研究方法，主要是客观描述大体标本中各器官系统的形态、大小、重量、位置、结构等以及对病变组织性状与特征等进行细致的观察和检测。
（二）显微形态研究方法
显微形态观察是借助光学显微镜或电子显微镜观察人体的微观形态结构，是组织学与胚胎学、细胞生物学、病理学等学科的基本研究方法。组织细胞经过固定、切片或适当的染色与化学显色反应等，可在显微镜下观察组织细胞的细微结构，包括常见的苏木精和伊红染色以及特殊染色。
利用组织和细胞对染料亲和力的差异进行不同组织的特殊染色，可对正常和病理组织细胞中黏液、纤维结缔组织、神经组织、脂质、糖类、核酸等某些特定成分进行定位、定量分析，常见的有过碘酸希夫（PAS）染色、马森（Masson）染色、中性脂肪染色、嗜银染色和抗酸染色等。免疫组织化学技术是结合免疫学原理，利用荧光素、酶或金属标记的抗体对组织细胞中特殊的化学成分（抗原或抗体）进行定性、定位和定量分析。常用的技术有免疫酶法、免疫荧光法、免疫电镜技术等，其中一些特殊显微镜，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜技术在免疫组织化学中用于特殊目标的精细观察。
尽管按基础学科的特点从机能学和形态学两方面介绍基础医学的主要研究方法，但值得注意的是，一些学科既会采用形态学观察，也会采用功能学的实验研究，因此，在进行基础医学研究时，应根据不同的目的，运用不同的研究技术与方法，从不同角度、不同层面去揭示机体组织的结构、功能及其疾病状态下的变化规律和机制。
第二节 医学基础研究技术的发展简史
细胞生物学是随着研究技术的建立与改进，不断积累认识而逐渐形成和发展起来的。1665年，英国人罗伯特 胡克（Robert Hooke）利用自己设计的显微镜第一次观察并描述了软木组织中的细胞结构。其后，人们从微观上进一步观察到动物体内的细微结构如细胞核的结构、毛细血管内的红细胞流动等。1838～1839年，根据前人和自己的研究工作，施万（Schwann）和施莱登（Schleiden）建立了细胞学说，认为“生物都是由细胞构成的，细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位”，成为 19世纪自然科学的三大发现之一。
19世纪中期，人们开始应用固定和染色技术，在光学显微镜下观察细胞的形态结构和细胞染色体在分裂中的变化。自 20世纪初至 20世纪中期，科学家们开始借助多种实验手段研究细胞的代谢和生理功能，美国动物学家哈里森（Harrison）建立了无菌操作技术程序，发明了悬滴培养法，观察到培养的神经元及轴突生长，因而被称为组织培养之父。之后美国学者伯罗斯（Burrows）在悬滴培养法中使用鸡血浆组织营养物；法国医生卡雷尔（Carrel）发明了体外哺乳细胞培养的胚胎提取液和血浆混合的培养基；美国科学家路易斯（Lewis）等开发了合成培养基，取代了天然培养基。卡雷尔发明了“卡式培养瓶”，马克西莫（Maximow）创造了“马克西莫双盖玻片培养法”，均利于防止培养过程中的偶然污染。此外，克洛德（Claude）建立了高速离心机法分离细胞核和细胞器，利于细胞组分和生理功能的研究。
1933年电子显微镜的发明和20世纪中期分子生物学的起步，开启了以亚显微结构与分子水平相结合的细胞生物学研究，逐步观察了内质网、溶酶体、核糖体等细胞器的显微结构。其次，20世纪中叶细胞培养技术开始快速发展，1952年杜尔贝科（Dulbecco）建立了胰蛋白酶消化技术，盖（Gey）等从宫颈癌患者亨利埃塔 拉克斯（Henrietta Lacks）体内分离活检组织的癌细胞，并培养建立了第一个永生的人类细胞系，即人宫颈癌海拉（HeLa）细胞系，该细胞系广泛用于研究各种因素对癌细胞生长的影响。20世纪60年代，托达罗（Todaro）和格林（Green）建立了来自小鼠胚胎的3T3成纤维细胞系，并证明培养细胞可发生自发性转化；克莱因史密斯（Kleinsmith）和皮尔斯（Pierce）同期证实了胚胎干细胞的多能性；1998年托马森（Thomason）等首次成功获得并培养了人胚胎干细胞系；2006年山中伸弥（Shinya Yamanaka）建立了诱导多能干细胞的培养技术，高桥雅代（Masayo Takahashi）于2014年将其首次应用于临床试验。
我国不少著名科学家为组织培养研究及应用也作出了重要贡献。20世纪30年代解剖学家张鋆首先开展软骨鱼血细胞培养，1934年发表《培养组织之创伤治疗》；其后又进行了脂肪细胞培养的研究。1955年细胞学家鲍鉴清出版了我国第一部《组织培养技术》专著。
细胞工程是以细胞为研究对象，进行细胞遗传性状改造，以获得特定的细胞、组织产品或新物种的一门综合性技术。20世纪70年代开始，细胞工程中细胞杂交技术、细胞融合技术、胚胎干细胞技术、核移植技术等不断发展完善。1963年，被誉为“中国克隆之父”的科学家童第周研究并培育出世界第一条克隆鱼；1984年维拉德森（Villadsen）利用胚胎细胞成功克隆出绵羊；1996年绵羊“多莉”（Dolly）作为首*成体细胞克隆出来的哺乳动物，成为又一个里程碑事件；2018年中国科学院神经科学研究所孙强团队成功用体细胞克隆了两只猕猴（“中中”和“华华”）。21世纪细胞工程已是现代生物技术与生命科学的前沿热点领域之一。
19世纪初期，法国植物学家拉斯帕伊（Raspail）发现了碘与淀粉的显色反应，其将化学技术与显微镜结合起来，成为组织化学技术的奠基者。1858年德国病理学家菲尔绍（Virchow）出版了《细胞病理学》，记载了亚铁氰化钾溶液处理组织的普鲁士蓝反应，显示陈旧性出血中铁的存在。此后也陆续建立了许多组织化学显色方法，如甲苯胺蓝染色法、染色质的甲基绿-派洛宁染色法。1909年曼（Mann）建立了较完善的组织冷冻切片技术，弥补了石蜡包埋组织制片技术的缺陷，扩大了组织化学的研究。
20世纪30年代，利松（Lison）的《动物的组织化学》和赫特维希（Hertwig）的《组织化学方法》等专著的出版，推动了组织化学的复兴与发展。至20纪世50年代，已针对细胞组分建立了经典的组织化学显色法。例如，显示蛋白质的偶氮色素四唑盐法以及改进的精氨酸法，显示网状纤维的银浸技术，以及胶原显示法、弹力纤维染色法；显示细胞核内DNA的福尔根-希夫（Feulgan-Schiff）反应和显示细胞核糖核酸（RNA）的甲基绿-派洛宁染色法；显示组织细胞内多糖、糖蛋白的过碘酸希夫反应法和显示酸性黏多糖和透明质酸的阿尔新蓝染色法；以及利用苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O、苏丹黑等脂溶性染料进行的脂类组织化学染色法。1939年，高松（Takamatsu）和戈莫里（Gomori）开发了碱性磷酸酶的化学显色法，标志着酶组织化学的开始。其后相继出现了酶定位的偶氮色素法、脱氢酶检测的偶氮色素四唑盐法等显示酶的方法。随着电子显微镜和超薄切片技术的发展，开创了电镜组织化学的新领域，可以在电镜下观察亚细胞水平酶的定位，如溶酶体内的酸性磷酸酶。
1941年，美国微生物学家孔斯（Coons）首次将一种异硫氰酸荧光素标记在肺炎球菌抗体上，示踪小鼠组织的肺炎球菌，开启了免疫组织化学技术的新纪元。1950年孔斯又提出了荧光抗体法，1966年中
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