**部分细胞与分子生物学实验
实验一细胞培养液的配制和无菌处理
实验二细胞的冻存和复苏
实验三细胞的荧光观察
实验四动物细胞的原代培养
实验五细胞的传代培养和外源基因转染
实验六细菌的接种、培养和保存
实验七离心机的使用
实验八超微量分光光度计的使用
实验九DNA的提取和含量测定
实验十质粒DNA的提取和鉴定
实验十一酵母RNA的提取和鉴定
实验十二聚合酶链反应
实验十三聚合酶链反应的引物设计实验十四PCR扩增和鉴定
实验十五DNA限制性内切酶酶切分析
实验十六载体DNA与目的基因片段的连接
实验十七大肠杆菌感受态细胞制备、转化和重组子筛选
实验十八目的基因在大肠杆菌中的表达和鉴定
实验十九蛋白质透析法脱盐
实验二十蛋白质凝胶过滤法脱盐
实验二十一血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳
实验二十二蛋白质印迹法
实验二十三谷丙转氨酶活性的测定
实验二十四影响唾液淀粉酶活性的因素
实验一细胞培养液的配制和无菌处理
一、 实验目的
（1） 掌握配制细胞基础培养液的方法和操作要求。
（2） 熟悉消化液、PBS溶液的配制和无菌处理。
（3） 了解培养基中主要的成分。
二、 实验原理
细胞培养液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液，主要包括平衡盐溶液、培养基及其他培养液。平衡盐溶液是组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH，常用于洗涤组织、细胞等。PBS溶液、Hanks溶液是两种常用的平衡盐溶液。培养基是维持细胞生长的营养物质，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养基中主要的成分包括氨基酸、碳水化合物、维生素、无机离子与微量元素。培养基可分为天然培养基、合成培养基和无血清培养基。合成培养基的化学成分明确，有利于细胞实验的重复，被广泛地使用，如RPMI1640、MEM等培养基。合成培养基需要添加血清，添加血清后的培养基又称为“完全培养基”。广泛应用的血清种类有马血清和牛血清，牛血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清。血清终浓度多为5%～20%，*常用的是10%。其他细胞培养液常用的是胰酶，用于消化细胞，浓度一般为0.1%～0.25%。配制好的培养基需要立即除菌，因培养基中部分化合物具有热不稳定性，因此对培养基进行除菌。
三、 实验材料
1. 药品和试剂干粉培养基（RPMI1640）、小牛血清、NaHCO3、稀盐酸、胰酶粉、双抗（青霉素、链霉素）、DHanks溶液、氯化钾、KH2PO4、NaCl、Na2HPO4 7H2O、三蒸水。
2. 仪器和材料真空抽滤装置1套、超净工作台1台、高压蒸汽灭菌锅1台、玻璃棒1根、pH计1台、电子天平1台、1000mL量筒1个、1000mL烧杯1个、1000mL和100mL容量瓶各1个、0.22μm微孔滤膜1张、50mL离心管1个、1mL移液枪1支、1mL枪头1盒。
四、 实验流程
干粉培养基（RPMI1640）→三蒸水溶解→加入双抗→加入NaHCO3→定容→调节pH→过滤除菌→热灭活血清→配成含血清10%的完全培养基→PBS溶液配制→配制0.25%胰蛋白酶。
五、 实验操作
1. 过滤器的准备和安装*先将润湿后的滤膜光面向上置于滤器上，然后将装有滤膜的滤器包装好，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后放入超净工作台内安装并检查，为过滤做准备。
2. RPMI1640基础培养基的配制将干粉培养基（RPMI1640）倒入烧杯中，加入总量1/3的三蒸水，再用总量1/3的三蒸水冲洗包装内面2次，一并倒入烧杯中置于磁力搅拌器搅拌溶解。根据产品说明书加入2g NaHCO3，以及终浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素。用稀盐酸调节培养基的pH为7.0～7.2。定容后过滤除菌。取45mL除菌后的合成培养基于50mL无菌离心管中，其余分装后于4℃冰箱内保存备用。
3. RPMI1640完全培养基的配制市售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。将血清放入56℃水浴锅中加热30 min，其间不时轻轻摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出。然后向装有45mL RPMI1640合成培养基的离心管中加入5mL小牛血清，则含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基就配制完成了。
4. PBS溶液配制分别称量 0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、2.16 g Na2HPO4 7H2O，混合在一起，加入800 mL三蒸水充分搅拌溶解，然后加入稀盐酸调pH至7.4，*后定容到1L即可。
5. 0.25%胰蛋白酶的配制称取0.25 g酶粉，加入适量的DHanks溶液搅拌溶解，溶解完全后定容至100 mL，*后滤过除菌即可。
六、 注意事项
（1） 培养基配制好后，要先抽取少许放入培养瓶内，在37℃温箱中放置24～48h，以检查培养基是否被污染。
（2） 完全培养基每次的配液量应以使用两周左右的量为宜。
七、 思考题
（1） Hanks溶液和DHanks溶液的区别是什么？
（2） 进行细胞培养时，培养基中为什么要加入一定量的小牛血清？
（3） 如何确认所配制的培养基没有被污染？
（张秀莉）
实验二细胞的冻存和复苏
一、 实验目的
（1） 掌握细胞冻存和复苏的原理及其操作过程。
（2） 熟悉细胞无菌操作理念。
二、 实验原理
细胞的代谢程度会随着环境温度的下降而减少。为了长时间保持细胞的状态，一般将细胞冻存在低温环境进行长期保存，如保存于-196℃液氮中，这个过程称为冻存。当需要使用细胞时，再把低温下的细胞解冻，重新培养，这个过程称为复苏。细胞复苏和冻存的基本原则是“缓慢冻存，快速复苏”。这样可以*大限度地保存细胞活力。细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应该采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞造成损害。
三、 实验材料
1 .药品和试剂胎牛血清、αMEM培养基、双抗（青霉素、链霉素）、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亚砜、HepG2细胞。
2. 仪器和材料离心机1台、冰箱1台、倒置显微镜1台、液氮罐、程序降温盒1个、水浴锅1个、T25培养瓶1个、废液缸1个、1mL和10μL枪头各1盒、移液枪1套、15mL离心管2个、冻存管1个、细胞计数板1块、标记笔1支、封口膜1卷。
四、 实验流程
1. 细胞冻存配制冻存液→消化细胞→终止消化→离心→重悬细胞→计数→装入冻存管→标注信息→程序降温盒降温→-80℃冰箱降温→液氮冻存。
2. 细胞复苏取出细胞→解冻细胞→加入培养基→离心→重悬→接种培养。
五、 实验操作
1. 细胞冻存按照胎牛血清∶二甲基亚砜=9∶1的比例配制好细胞冻存液备用。取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶溶液把单层生长的细胞消化下来，移至15mL离心管中。1000 r/min离心5 min。去除上清液，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的*终密度为1×106/mL左右。在冻存管上标注细胞的名称，冻存时间及操作者。冻存： 拧紧冻存管盖，放置于冻存盒内转移至-80℃冰箱内过夜，第二日转移至液氮中。也可采用梯度降温的方式进行冻存，4℃放置 20min、-20℃放置30min、-80℃过夜，第二日转移至液氮中。
2. 细胞复苏从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃水浴中，并不时摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，75%酒精消毒后移入超净工作台，打开冻存管盖子，用吸管吸出细胞悬液转入离心管中并加入5倍左右培养液，混匀。1000 r/min离心5 min。弃去上层清液，加入含10%胎牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶。标注细胞名称、代数、日期后，37℃培养箱静置培养。次日更换一次培养液，继续培养。
六、 注意事项
（1） 在冻存和复苏细胞过程中，要避免被液氨冻伤，操作时应戴好护目镜和手套。
（2） 冻存前，应仔细检查细胞冻存管是否密封，以免复苏时因受热发生爆炸伤人。
（3） 运用“缓慢冻存，快速复苏”的原理处理细胞。
七、 思考题
（1） 从液氮中取细胞时应采取哪些安全防护措施？
（2） 细胞冻存和复苏的基本原则是什么？
（张秀莉）
实验三细胞的荧光观察
一、 实验目的
（1） 掌握免疫荧光标记技术的原理。
（2） 熟悉细胞标本处理和免疫染色的操作流程。
（3） 了解正置荧光显微镜观察细胞内特定蛋白质分布的方法。
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