第一部分 微生物学基础实验
第一单元 无菌概念和无菌操作技术
实验1-1 环境及人体表面微生物的检测
【目的要求】
1．证实环境中普遍存在微生物；确立无菌概念，体会无菌操作技术的重要性。
2．观察不同类群微生物的菌落特征。
【基本原理】
微生物多种多样，无处不在。它们很小，肉眼看不见。将它们接种到适当的固体培养基上，在适宜温度培养，少量分散的菌体或孢子就可以在培养基上形成肉眼可见的细胞群体——菌落（colony）。不同种的微生物可形成大小、形态、颜色等特征各异的菌落。因此，可以通过平板培养检查环境中微生物的类型和数量。
【实验器材】
牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基（附录二），马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基；无菌水，无菌棉签，试管架，酒精灯，记号笔，培养箱等。
【操作步骤】
1．标记 在一套牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基的底部划出8个等分的小区，并分别标注姓名、日期及代表不同样品的字母（A～H）。在另外两套马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基的底部分别标注空气1、空气2及姓名、日期。
2．检测 环境及人体表面的微生物多种多样，检测方法各不相同。
（1）空气 将标有空气1的平板培养基打开皿盖，放于实验台上，使培养基表面完全暴露在空气中；将标有空气2的平板培养基打开皿盖，放于已灭菌的超净工作台上或接种箱（室）内，1 h后盖上各皿盖。
（2）人体表面及其他物体上的微生物
1）手指：在酒精灯火焰旁，半开皿盖，用未洗的手指在平板培养基的A区内轻轻按一下，迅速盖上皿盖。然后用肥皂洗净双手，自然干燥后仍用同一手指在平板培养基的B区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。
2）头发：将1或2根头发轻轻放在平板培养基的C区，迅速盖上皿盖。
3）鼻腔：按无菌操作，从试管中取无菌湿棉签在自己鼻腔内滚动数次，立即在平板培养基的D区轻轻划线接种，迅速盖上皿盖。将用过的棉签放入另一试管。
4）桌面：按无菌操作，从试管中取无菌湿棉签擦抹实验台面约2 cm2，将棉签从皿盖开启处伸至培养基表面，在E区划线接种，立即盖上皿盖。放回棉签。
5）水体：按无菌操作，从试管中取无菌干棉签，分别蘸取少量无菌水、自来水，将棉签从皿盖开启处伸至培养基表面，分别在F区和G区轻轻划线接种。
6）地面：按无菌操作，从试管中取无菌湿棉签，擦抹实验室地面约2 cm2，将棉签从皿盖开启处伸至培养基表面，在H区轻轻划线接种。
3．培养 将牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基倒置于37℃培养箱中，将马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基倒置于28℃培养箱中，培养3 d。
4．观察 若有时间，可从第24 h起连续观察数次，仔细观察各培养基上不同类型菌落出现的顺序及菌落大小、外形、颜色、数量等的变化。
【实验报告】
1．实验结果 将观察结果记录在表1-1.1中。
2．思考题
1）比较不同来源的样品，哪种样品平板菌落数量和类型*多？为什么？
2）比较洗手前后及空气处理前后菌落的变化，体会严格无菌操作的意义。
【注意事项】
1．标记一定要记在皿底，记在皿盖容易张冠李戴。各样品不能记错。
2．接种要严格无菌操作，在酒精灯火焰旁进行，动作要迅速，不能划破培养基。
（蔡信之）
实验1-2 无菌操作技术
【目的要求】
准确掌握实验室微生物挑菌、接种的无菌操作技术；认真体会无菌操作要领。
【基本原理】
微生物学实验中，无菌操作技术是指为防止杂菌污染纯培养物而采取的一系列措施后的挑菌、接种操作。接种前应向地面洒水，清理台面，移走不必要的物品，用湿布拭净灰尘，消毒台面，洗净双手。菌种管和待接种管都插在试管架上，放在取放方便的位置。接种应在酒精灯火焰旁严格按无菌操作规程（图1-2.1）进行。高温对微生物有致死效应。切忌边接种边聊天和随意走动，以防止杂菌污染。
【实验器材】
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；牛肉膏蛋白胨斜面培养基；酒精灯，接种环，试管架，记号笔等。
【操作步骤】
1．标记 用记号笔在斜面前方距管口2～3 cm处，分别标记3支装有牛肉膏蛋白胨斜面培养基的试管为A（接菌）、B（接无菌水）、C（非无菌操作接无菌水）。
2．灭菌 左手持装有大肠埃希氏菌菌种和待接种的斜面培养基试管，右手持接种环，按图1-2.1的1及图1-2.2所示的方法将接种环在火焰的氧化焰彻底灼烧灭菌（烧红并持续一段时间），再在火焰旁打开装有斜面菌种和待接种斜面培养基试管的棉塞（图1-2.1的2）（棉塞不能放在桌上，应夹在右手指间并朝外），在火焰上灼烧管口。
3．挑菌 在火焰旁将接种环插入菌种培养基上部空白处冷却5 s以上，挑取少许菌苔，将接种环退出菌种管。
4．接种 将已挑菌的接种环迅速伸入A管斜面底部（环不要碰试管口和壁），从底部开始向上做蛇形密集划线接种（图1-2.1的3）。划线完毕后灼烧管口，塞上棉塞。将接种环彻底灼烧后放回原处（图1-2.1的4和5）。
5．接水 同样接种无菌水于B管。
6．对照 以非无菌操作为对照：在无酒精灯或煤气灯的条件下，用未经灭菌的接种环从另一盛有无菌水的试管中挑取一环无菌水划线接种到C管中。
7．培养 将A、B、C 3支牛肉膏蛋白胨斜面培养基于37℃直立培养24 h。
8．观察 仔细观察A、B、C斜面培养基表面有无纯培养的菌苔生长。
图1-2.1 无菌操作过程
1.烧杯；2.拔塞；3.接种；4.加塞；5.烧杯
【实验报告】
1．实验结果 分别描述试管A、B、C斜面培养基表面菌苔生长情况。
2．思考题
1）斜面试管A、B、C各起什么作用？你从中体会到什么？
2）你的实验结果正确吗？试解释之。
3）接种时开塞后试管口或锥形瓶口可否朝上？能否远离火焰？为什么？
【注意事项】
1．无菌操作的试管或锥形瓶在开塞后及回塞前，其口部均应通过火焰2或3次，以烧去可能附着于口部的微生物。开塞后的管口及瓶口应尽量靠近火焰，平放，切忌口部向上及长时间暴露在空气中，以防止污染。
2．接种环（或针）每次使用前后，均应在火焰外焰彻底灼烧灭菌。
3．挑菌前，必须待接种环（或针）充分冷却后才能使用，以免烫死微生物。
图1-2.2 接种环（或针）灭菌
（蔡信之）
第二单元 显微技术
实验1-3 显微镜的使用及细菌形态的观察
熟悉显微镜并掌握其使用技术是研究微生物必不可少的重要手段。配合数码显微摄影技术的使用，对微生物的观察不仅快速、准确，而且便于编辑、储存。
显微镜可分为光学显微镜和非光学显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、紫外光显微镜、微分干涉相差显微镜等不同类型。非光学显微镜主要是电子显微镜。
一、普通光学显微镜
【目的要求】
1．熟悉普通光学显微镜各部分的结构和性能。
2．掌握油镜的基本原理和使用方法。
3．观察细菌的基本形态。
【基本原理】
1．显微镜的结构 光学显微镜分机械装置和光学系统两大部分（图1-3.1）。
图1-3.1 光学显微镜的结构
（1）机械装置
1）镜座和镜臂：镜座位于显微镜底部，马蹄形或方形，是显微镜的基座，由它支撑全镜。有的显微镜在镜座内装有照明光源等。
镜臂是显微镜的脊梁，支撑镜筒。直筒显微镜镜臂与镜座间有一倾斜关节，可使显微镜倾斜一定角度，便于观察。
2）镜筒：是一金属圆筒，上接目镜，下接转换器，镜筒长通常是160mm，有些显微镜镜筒长度是可调的。根据镜筒数量，光学显微镜分单筒式和双筒式。
3）物镜转换器：是一安装物镜的圆盘，其上可装3或4个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。转换物镜时必须用手按住圆盘旋转。
4）载物台：又称镜台，用于安放玻片标本。中心有一个通光孔。载物台上装有一副金属的玻片夹推进器。调节移动器上的螺旋可使标本前后、左右移动。有些移动器上还有刻度，可确定标本的位置，便于重复观察。
5）调焦装置：是调节物镜和标本间距离的机件，有粗调节器和细调节器，可使镜筒或镜台上下移动。当物体在物镜的焦点上时，可得到清晰的图像。
（2）光学系统
1）目镜：目镜装于镜筒上端，作用是把物镜放大的物像再次放大，但不提高分辨率。它由两片透镜组成，在两块透镜中间或下方有一视野光阑。在进行显微测量时要将目镜测微尺放在视野光阑上。不同的目镜上面一般标有5×、10×、16×等放大倍数，不同放大倍数的目镜，其口径是统一的，可以互换使用。
2）物镜：物镜是显微镜*重要的部件，由多块透镜组成。它决定成像质量和分辨能力。因靠近被观察的物体，又称为接物镜。作用是将物体进行第一次放大。
各物镜都刻有放大倍数（低倍镜为10×；高倍镜为40×～65×；油镜为95×～100×）、数值孔径（numerical aperture，NA）、镜筒长度及所要求的盖玻片厚度等参数（图1-3.2）。
图1-3.2 显微镜的主要参数
1．放大倍数及数值孔径；2．镜筒长度（mm）及盖玻片厚度（mm）；3．工作距离（mm）
3）聚光器：聚光器由聚光镜和可变光阑组成，装在镜台下，可上下升降。边框上刻有数值孔径。作用是将平行的光线聚集到标本上，增强照明度。用低倍镜时聚光器应下降，用油镜时则要升到*高位置。在聚光镜的下方装有可变光阑（光圈），由十几张金属薄片组成，可放大或缩小，以调节光强度和数值孔径的大小。
4）反光镜：是一个有平凹两面的双面镜，装在聚光器下的镜座上，可在水平与垂直两个方向任意旋转。作用是采集光线并将其射向聚光器。光线较强或用低倍和高倍镜观察时用平面镜；光线较弱或用油镜观察时应用凹面镜。带电光源的显微镜通过调节电源
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