第1章 胞外囊泡的分离和表征：传统与现代技术
Ahmed E. Noreldin，Asmaa F. Khafaga，Rasha A. Barakat
摘要
胞外囊泡（EV）是包含复杂细胞信息的微小膜泡。由于EV在胞间通讯和临床上的预后症状、诊断和治疗的作用，近年来EV研究备受关注。在本章中，我们概括了EV分离和表征的已有技术并介绍了这些技术的局限性和发展方向。此外，我们将着重介绍EV分离表征的新型技术及其发展状况。
关键词
缩略词
1.1 引言
胞外囊泡（EV）是大多数细胞都能够分泌的磷脂双分子层膜泡。由于其在疾病和生理中重要的生物学作用，近几年，EV成为生物医学研究领域的热点（Bank等2015；Colombo等，2014；Quek and Hill，2017）。*近，人们发现EV介导的细胞间通讯在癌症转移过程中扮演了重要的角色；一方面，EV扩散到肿瘤微环境后增强了免疫调节、基质重塑和血管生成等一系列反应（Al-Nedawi等，2008；Andreola等，2002；Huber等，2005；Luga等，2012；Skog等，2008）。另一方面，通过增强肿瘤细胞的迁移、增殖、耐化疗和上皮-间充质转化的能力，EV向肿瘤细胞的转移加剧了肿瘤发生（Au Yeung等，2016；Leca等，2016；Luga等，2012；Richards等，2017）。除此之外，EV也会在肿瘤远端位点处创造转移前龛（Alderton，2012；Costa-Silva等，2015；Peinado等，2012；Somasundaram 和Herlyn，2012）。
Chargaff 和West（1946）*早在血液中检测到了EV，Wolf（1967）将其命名为“血小板灰尘”。后来，研究者们在直肠腺瘤微绒毛细胞提取出了EV，并将其描述为“质膜碎片”（De Broe等，1977）。1983年，Harding等深入研究后发现，囊泡是由质膜与多泡体（MVBs）结合而形成的（Harding等，1983）。在那之后，Raposo和他的同事们报道了从病毒转化的B淋巴细胞中分离出来的囊泡，具有刺激T细胞反应的能力（Raposo等，1996）。2007年，由于EV中RNA的发现，EV被证明是细胞之间通讯的媒介而因此备受关注（Valadi等，2007）。
EV可以作为各种疾病的潜在生物标志物，这是由于其含有细胞分泌的脂质、核酸和蛋白质等多种物质。鉴于尿液（Duijvesz等，2011）、血液（Caby等，2005）、脑脊液（CSF）（Chen等，2013）、唾液（Yang等，2014）等含EV的液体样本采集相对方便，可以考虑用EV活检来替代常规活检（Wu等，2017）。目前，EV作为一种潜在的生物标志物已经被用于包括癌症在内许多疾病的研究（Choi，2015；Merchant等，2017；Moon等，2016）。
除了预后和诊断潜力外，EV或脂质体作为靶向治疗载体的应用研究也在进行中（Crivelli等，2017；Usman等，2018；van der Meel等，2014）。在临床上，人间充质干细胞（MSC）源的EV已经证明了它们的治疗能力。例如，与仅使用间充质干细胞相比，使用间充质干细胞来源的EV治疗急性肾损伤（AKI）的小鼠可以恢复AKI的功能（Bruno等，2009）。此外，产生心肌缺血/再灌注损伤后，使用间充质干细胞来源的EV治疗可保护心脏功能（Arslan等，2013）。因此，为了开发利用EV的生物医学能力，建立一种能够分析测定EV在样品中的浓度和分子组成的方法是非常有必要的。
但临床和生物EV样本的复杂性和EV的多样性阻碍了EV分析。根据EV生物起源可以将其家族分为三大类：凋亡小体、微囊泡和外泌体（Raposo和Stoorvo-gel，2013）。外泌体直径较小（40～100nm），在核内体腔室形成，通过多泡体与质膜结合排出。微囊泡直径在100～1000nm，由质膜内凹直接产生。凋亡小体的直径从50nm到5μm不等，经由程序性细胞死亡过程中细胞膜出芽所分泌。EV生物发生和分泌的主要途径如彩图1和图1.1所示。
图1.1 EV的分泌。外泌体和微囊泡由活细胞自发或者通过激活分泌出来，其中微泡可通过质膜凸起直接分泌，而外泌体则由多泡体形成。此外，凋亡小体由经历程序性死亡的细胞以膜出芽的方式形成EV*近已被证实具有形态多样性。科学家通过利用冷冻电子显微镜（cryo-EM），在体液样本中观测到了不同形态的EV（Hoog和Lotvall，2015）。在人类精液中，约41%的EV为双囊泡、卵形囊泡、三囊泡、双特殊囊泡、层状小体和小管，其余为单囊泡（Hoog和Lotvall，2015）。这些不同形态的EV表明，EV在分类上存在不同的亚群，并且这些亚群可能具有不同的生化特性。由于EV种类繁多，为了解其在生理和病理中的组分和功能，有必要对其进行分类。此外，对各种细胞来源EV的分析方法也在不断推陈出新。*近，一个多层面的EV精制计划已经被应用于精准收集特异性EV亚群，方便研究者对EV载体进行深入分析，因此，有关特定EV或基于EV的生物标志物的功能和组分特性也将被人熟知。
本章节主要阐述EV表征和定量新技术的发展，以及这些技术广阔的发展前景。在本章中，我们尽力向读者展现目前该研究领域的广度。首先，我们总结了*常用的EV分离方法，随后我们对EV表征方法进行了分类。
1.2 分离技术
目前已经相对成熟的EV亚群分离技术主要分为五类，即基于体积的筛选、差异超速离心、聚合物吸附共沉淀、免疫亲和捕获法和微流控技术。不同的EV亚群如图1.2所示。
1.2.1 基于差速超速离心技术（DUC）
DUC是EV分离*常见的方法。在DUC中，颗粒会根据其形状、大小和密度分级沉淀。将上清液以高离心力进行再次离心，颗粒团就会被分配到相应的介质层中，那么不同的EV组分通过多次离心即可实现分离（Yamashita等，2016）。相应的离心时间取决于溶剂的黏度和粒子的物理特性。此外，在分析体液样本溶液时，EV颗粒团还包括脂蛋白、粗蛋白和各种悬浮粒子等污染物。在超速离心之后，可以采用密度梯度离心去除杂质。这一套次序流程被喻为EV分选的“黄金标准”（Mateescu等，2017）。但另一方面，密度梯度离心法需要设备成本高昂（50 000～100 000美元）（Aalberts等，2012；Palma等，2012），且对复杂生物样本进行分析需要花费较多时间（62～90h，Taylor和Shah，2015）。因此，对于设施条件一般的实验室或者常规医院，该方法并不适用于大规模的样本处理（Liga等，2015）。此外，脂蛋白污染、离心导致的EV破碎，以及EV本身的低得率（5%～25%的回收率）（Lamparski等，2002），都限制了该方法在临床上应用。除此之外，DUC方法会提高浓缩悬浮液中EV的积聚，同时EV也会因反复冻融受损从而导致生物活性改变（Bosch等，2016）。但有报道称，添加25mmol/L海藻糖可以保护冻融过程中EV的质膜免受损害并减少离心后EV的积聚（Bosch等，2016）。经典的超速离心法如彩图2和图1.2中所示。
图1.2 EV的不同亚群。EV各亚型的体积与释放途径大相径庭。从多泡体中释放的外泌体，负责运输蛋白和mRNA用于细胞间的通讯。根据体积不同，外泌体可分为大小外泌体。外泌颗粒（＜50nm）负责运输代谢相关蛋白。细胞微泡比外泌体略大，可以支持细胞间通讯。而从癌细胞中出芽形成的致癌外泌体则是一类较大的胞外囊泡，可以帮助肿瘤细胞入侵机体。迁移体是在细胞迁移后形成的，目前功能尚未可知
1.2.2 基于体积尺寸的筛选技术
基于体积尺寸的筛选技术，例如超滤法和体积排阻层析（size-exclusion chro-matography，SEC）会根据EV的体积大小对其进行分离。在超滤法中，一种已知大小的膜只允许少量种类的粒子颗粒通过。相较而言，超滤法比超速离心法速度快，但后者操作简便，不需要特殊的试剂和设备。另一方面，由于大囊泡的溶解和剪切力引起的囊泡变形，蛋白质污染和生物活性较低等是难以避免的。此外，由于和质膜连接，分离过程中产生的EV损耗也可能会影响下游分析的结果（Batrakova和Kim，2015）。SEC是另一个根据EV形态大小进行的分离技术。SEC中含有孔洞的固定相会根据EV大小将其分离。
1.2.3 基于免疫亲和捕获法
免疫亲和捕获法是先使用磁珠或者分子底物捕获EV，将目标分子固定在其表面，然后使用特定的洗脱液回收。已知EV包含不同的膜标志物。而一个优良的免疫选择生物标志物的标准是能够专一结合EV表面并且不会与其他标志物共溶于相同的洗脱液。少量样本采用免疫亲和法得到的结果与超速离心相似。然而，由于EV表面标志物与捕获分子之间特异性、高效性和亲和性使得这种技术比超速离心法更为有效（Tauro等，2012）。
1.2.4 基于聚合物沉淀
添加聚乙二醇（PEG）等聚合物可以改变EV的分散性或溶解性，进而将其从体液样本中分离出来。PEG一般用于分离病毒。加入PEG沉淀后采用低速离心即可得到EV沉淀。因此，聚合物沉淀技术不需要任何特殊设备并且易于分离，这种技术也因此可用于临床和大规模制备（Batrakova和Kim，2015）。但是，残留的聚合物及其他杂蛋白会污染分离后的产物（Taylor和Shah，2015）。为了减少污染，必须进行分离前后的纯化步骤。分离前主要去除像脂蛋白这样的亚细胞颗粒，而分离后则利用脱盐柱（如Sephadex G-25）去除剩余的聚合物（Taylor和Shah，2015）。
1.2.5 微流控技术
微流控技术的迅速发展为EV的分离提供了一种新的探索。基于EV的生化和物理特性，微流控系统可以实现小规模EV的高效分离。在临床上，利用微流控技术开发了一种新的EV检测方法。与传统方法相比，这种技术所需要的样本数量更少，灵敏度更高，速度更快。之前微流体免疫亲和技术已被报道用于EV分选（He等，2014；Kanwar等，2014）。从捕获的EV中提取的RNA的浓度和质量足以用于芯片分析或聚合酶链反应（PCR）。然而免疫亲和法只能分离出具有特定表面蛋白的EV（Liga等，2015），而带有微流控装置的多孔聚合物筛网可以在没有免疫选择性的情况下收集EV。
采用电泳过滤可以减少污染、EV聚合和孔隙堵塞。微流控装置由于装置较小，因此可以使用一个很低的电压。Wang等报道了一种利用纤毛纳米丝微柱层析结构，该结构可以基于脂质体体积大小对其进行靶向吸附（Wang等，2013）。吸附后的硅胶纳米线在磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜浸泡溶解可以释放靶向吸附颗粒。*近，非对称流场流分馏（AF4）技术也被报道应用于对聚合物、纳米粒子、EV和蛋白质进行表征和分类（Gigault等，2014）。在AF4中，通过层面切向流将样品引入平面通道，然后通过横向流将样品按照扩散系数进行分组收集。然而，大多数分选技术仍然需要更多诸如核酸提取或样品制备这样的非芯片操作。
1.3 胞外囊泡的特征
为了对微囊泡、凋亡小体和外泌体等不同大小的EV进行分类研究，研究者们
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