第一章 发酵前处理
实验一 葡萄成熟度分析实验
一、目的意义
（1）熟悉酿酒葡萄成熟评价的指标；
（2）能够选择成熟指标，综合评价酿酒葡萄原料的成熟状况。
二、基础理论
葡萄酒是以新鲜的葡萄或者葡萄汁为原料，经发酵而成的含酒精的饮料，因此葡萄原料的成熟度与葡萄酒的质量密切相关。果实品质在很大程度上取决于葡萄的采收时间，过早或过晚采收，酿造出的葡萄酒均不能完美呈现其品种的风味特征，甚至会造成质量缺陷。因此浆果转色后检测葡萄的成熟度对于科学地确定采收期、提高葡萄酒的质量和产量具有重要意义。
葡萄浆果进入转色期后，果实中的主要成分随之发生变化。首先表现在糖含量的不断攀升，在成熟时可达200～250 g/L，这是由于葡萄植株的其他器官，如主干、主枝、叶片、果梗等的积累物质向果实不断运输。与之相反的是葡萄浆果的有机酸迅速降低，并在成熟时趋于稳定，因为这一阶段果实的呼吸作用以苹果酸为主的有机酸为基质，且在炎热产区，呼吸强度较大，有机酸降解更为迅速。因此，在温带气候区常根据葡萄的糖酸比（也称成熟系数）作为果实成熟的指标。其中，葡萄的含糖量可通过斐林试剂法检测，首先葡萄汁中的多糖通过酸水解转化为还原糖，还原糖与斐林试剂共同煮沸，斐林试剂中的硫酸铜被还原生成红色的氧化亚铜沉淀。以次甲基蓝为指示液，当反应到达终点时，稍微过量的还原糖能够将蓝色的次甲基蓝还原为无色，从而使反应液由蓝色变为红色，以示终点。葡萄浆果的含酸量可利用酸碱滴定的原理，以酚酞作为指示剂，用碱标准溶液滴定，根据碱的用量计算总酸的含量。
此外，由于成熟的葡萄浆果中糖是浓度*大的组分，在某种程度上，可溶性固形物可以衡量葡萄的成熟情况。可溶性固形物指样品中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等，用白利度（Brix）表示。描述样品中可溶性固体含量的质量百分比浓度，通常利用可溶性固体的折射性检测。光线从一种介质进入另一种介质时会产生折射现象，并且入射角正弦之比为恒定值，此比值称为折光率。葡萄汁液中可溶性固形物的含量与折光率在一定条件下（同一温度、压力）成正比例关系，故可通过使用手持糖量计测定葡萄汁液的折光率，求出葡萄汁液可溶性固形物的含量。
检测葡萄浆果的可溶性固形物及成熟系数操作简单，但以这两种方法确定红葡萄的采收期仍具有一定的片面性，因为红葡萄酒的质量还依赖于存在于果皮中的单宁和花色苷，所以多酚成熟度也广受关注。多酚的检测可利用福林-肖卡法，即在碱性溶液中，多酚物质将磷钼酸和钨酸盐还原成蓝色的化合物，其中蓝色的深浅程度与多酚物质的含量成正比，因此可利用比色法对总酚进行定量。而对花色苷的检测则依据在不同pH条件下，由于花色苷浸出的量不同，从而表现出不同的光谱特征。在pH为1.0的条件下，很容易破坏果皮细胞壁，几乎所有的花色苷可以浸出。此外，花色苷可被二氧化硫或焦亚硫酸钾漂白，其可见光的光谱特征进而消失。利用样品漂白前后吸光度的差值，结合标准曲线，可计算出其相应含量。
在浆果发育过程中，葡萄果皮中的优质单宁和花色苷含量逐渐积累，同时种子中的劣质单宁含量逐渐降低。*佳多酚成熟度不仅指果皮中的色素和优质单宁达到*大值而种子中的单宁含量较低，而且也表现在发酵过程中有良好的浸提能力，这可以通过葡萄浆果的多酚系数反映。在不同pH条件下，果皮中单宁的浸出同花色苷的情况基本一致，在pH为1的条件下能够得到充分浸提。若浆果成熟度良好，其细胞壁通透性好，在模拟发酵条件下，即pH为3.2时，浸出的花色苷或单宁与pH为1的条件下相比差值较小。
三、材料与器皿
1．材料
不同品种的葡萄浆果。
2．试剂
乙醇、焦亚硫酸钾、1 mol/L盐酸、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、酒石酸钾钠、硫酸铜、酚酞、葡萄糖、次甲基蓝、浓盐酸、二水合钨酸钠、二水合钼酸钠、85%磷酸、一水合硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、十水合碳酸钠、亚硫酸钠、酒石酸、五倍子酸、锦葵色素-3-葡萄糖苷等。
3．仪器与器皿
容量瓶、烧杯、离心管、玻璃纤维滤膜、三角烧瓶、冷凝管、蒸馏水瓶、圆底烧瓶、锥形瓶、移液枪、移液管、pH计、手持糖量计、滴定管、比色皿、电炉、烘箱、干燥器、紫外-可见光分光光度计、水浴锅等。
四、实验操作流程
实验操作流程如图1-1所示。
五、实验步骤
（一）采样及破碎取汁
葡萄浆果转色后开始采样，早期每周一次，随着葡萄成熟期临近可调整采样频率为每3～4 d一次。葡萄果实的取样范围覆盖整个葡萄园，但为保证采样检测的客观性，葡萄园*外侧的两行及每一行两端的葡萄树应忽略，一般可在同一片葡萄园中按照一定的间隔标记250株葡萄树，每株随机摘取3粒，分成3份。
1．可溶性固形物、糖、酸含量的检测
取样后立即将所采取的其中一份250粒浆果压汁，检测浆果的含糖量及含酸量。
2．福林-肖卡法检验总酚
在另一份葡萄中随机选取30粒浆果，并将其分成3组，每组10粒葡萄。剥离每粒葡萄的果皮和葡萄籽，用滤纸去除其表面的果肉，称量后放入黑胶带包裹的50 mL离心管中，加入10倍质量的缓冲液［18%体积分数（volume fraction，vol）乙醇，900 mg/L焦亚硫酸钾，7.5 g/L酒石酸，pH 3.2］，25℃、100 r/min充分浸提3 d，取上清液避光保存于－20℃冰箱，用福林-肖卡法检测酚类物质的含量。
3．多酚系数、花色苷含量的检测
第三份葡萄先粉碎，然后分别称取2份50 g葡萄浆，随后在每份葡萄浆中加入150 mL蒸馏水。其中一份用1 mol/L盐酸调整pH至1.0，然后加入蒸馏水至400 mL；另一份葡萄浆用饱和酒石酸调整pH至3.2，然后再加入蒸馏水至400 mL。两份样在室温放置4 h，并不时搅动，然后用玻璃纤维膜滤出清汁。用于检测多酚系数及花色苷含量。
（二）可溶性固形物含量
1．仪器的校正
打开手持糖量计（图1-2）盖板，用软布仔细擦净检测棱镜。取蒸馏水数滴，放在检测棱镜上，使蒸馏水遍布棱镜表面，拧动零位调节螺钉，使分界线调节至刻度为0的位置。擦净棱镜后即可进行检测。
2．样品测定
取待测溶液数滴，置于检测棱镜上，轻轻合上盖板（避免产生气泡），使溶液遍布棱镜表面。将仪器进光板对准光源或者明亮处，眼睛从目镜中观察视场，转动目镜调节手轮使视场中的蓝白分界线清晰。分界线上对应的刻度值即为检测溶液的可溶性固形物含量，结果如图1-2所示。
（三）含糖量
1．配制试剂
葡萄糖标准溶液：2.5 g/L。将葡萄糖在105～110℃的烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷却，准确称取2.5000 g（精确至0.0001 g），用适量水溶解并定容至1000 mL。
次甲基蓝指示液：10 g/L。称取1.0 g次甲基蓝，用适量水溶解并定容至100 mL。
斐林试剂A液：称取34.7 g硫酸铜晶体（CuSO4?5H2O），用适量去离子水溶解并定容至500 mL。
斐林试剂B液：分别称取173.0 g酒石酸钾钠晶体（C4H4KNaO6?4H2O）和50 g氢氧化钠，用适量去离子水溶解定容至500 mL。
2．标定斐林试剂A、B液
预备实验：吸取斐林试剂A、B液各5.00 mL于250 mL锥形瓶中，加50 mL去离子水，混合均匀，在电炉上加热至沸腾。在沸腾状态下，用葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色消失而呈现红色时，加两滴蓝色的次甲基蓝指示剂，此时，溶液又变成红色，继续使用葡萄糖标准溶液滴定，直至溶液的蓝色消失。记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。
正式实验：吸取斐林试剂A、B液各5.00 mL于250 mL锥形瓶中，加50 mL去离子水和比预备实验少1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸腾，2 min后，加2滴蓝色的次甲基蓝指示剂，在沸腾状态下，于1 min内用葡萄糖标准溶液滴定至滴定终点（溶液的蓝色消失而呈现红色）。记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
计算：按公式（1-1）计算斐林试剂A、B液各5.00 mL相当于葡萄糖的质量。
（1-1）
式中：F为斐林试剂A、B液各5.00 mL相当于葡萄糖的质量，单位为克（g）；m0为配制1 L葡萄糖标准溶液称取的葡萄糖质量，单位为克（g）；V0为消耗葡萄糖标准溶液的总体积，单位为毫升（mL）。
3．样品测定
准确吸取一定量的“（一）采样及破碎取汁”中“1．可溶性固形物、糖、酸含量的检测”中的样品（体积V1）于容量瓶（体积V2）中，使之所含总含糖量为0.2～0.4 g，加5 mL盐酸溶液（1∶1），用去离子水稀释至20 mL，混合均匀后，于（68±1）℃水浴水解15 min，取出，冷却，用氢氧化钠溶液中和至中性，调溶液温度为20℃，用水定容至刻度，制得葡萄酒样品溶液。以葡萄酒样品溶液代替葡萄糖标准溶液，按上述标定斐林试剂A、B液的操作方法操作，记录消耗葡萄酒样品溶液的体积（V3），按公式（1-2）计算葡萄酒样品中的含糖量。
（1-2）
式中：m为1 L葡萄酒样品或干葡萄酒样品中的含糖量，单位为克（g）；V1为吸取葡萄酒样品或干葡萄酒样品的体积，单位为毫升（mL）；V2为葡萄酒样品或干葡萄酒样品定容后的体积，单位为毫升（mL）；V3为消耗葡萄酒样品溶液或干葡萄酒样品溶液的体积，单位为毫升（mL）。
（四）含酸量
1．配制试剂
氢氧化钠标准溶液：0.05 mol/L。称取2.0000 g氢氧化钠，用适量去离子水溶解并定容至1000 mL。
无二氧化碳水：取一定量的蒸馏水，加热至沸腾并保持沸腾状态5～10 min。
邻苯二甲酸：6 g/L。将邻苯二甲酸氢钾在105～110℃的烘箱中干燥2 h，取出，置于干燥器中冷却。准确称取0.3000 g，用适量无二氧化碳水溶解并定容至50 mL。
酚酞指示剂：10 g/L。取1.0 g酚酞，用适量水溶解并定容至100 mL。
2．标定氢氧化钠标准溶液
在配制好的邻苯二甲酸溶液中加入2滴酚酞试剂，用配制的氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色，保持30 s不褪色，即为终点。按照公式（1-3）计算氢氧化钠的浓度。
（1-3）
式中：C为氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m为邻苯二甲酸的质量，单位为克（g）；V为滴定邻苯二甲酸溶液消耗的氢氧化钠溶液的体积，单位为毫升（mL）；V0为空白试验消耗的氢氧化钠溶液的体积，单位为毫升（mL）。
3．样品测定
吸取2.00 mL“（一）采样及破碎取汁”中“1．可溶性固形物、糖、酸含量的检测”中的样品（液体温度20℃）于250 mL烧杯中，加入50 mL蒸馏水及2滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色，并保持30 s不褪色，即为终点。同时做空白试验。按照公式（1-4）计算样品中的总酸，*后所得结果保留一位小数。
（1-4）
式中：X为样品中总酸的含量（以酒石酸计算），单位为克每升（g/L）；C为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；V0为空白试验消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；V1为样品滴定时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；V2为量取样品的体积，单位为毫升（mL）；75为酒石酸的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/mol）。
4．精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的3%。
（五）成熟系数的计算
测得含糖量和含酸量后，按照以下公式计算成熟系数：
（1-5）
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