第1章绪论
　　1.1引言
　　作为21世纪新一代制造技术的代表，三维（3D）打印在军事、科研、医疗、能源等领域都展现出了巨大应用潜力。将3D打印技术应用于生物材料的加工制造，将大大助力生物材料在基础研究和临床转化上的应用。从医学模型和术前规划的原型制造，到三维多孔组织工程支架制造，再到活细胞的直接组装（生物3D打印），生物材料3D打印的发展经历了从无生命到有生命的跨越。
　　本章将从3D打印制造技术的基本概念与原理出发，简述用于3D打印的生物材料及典型技术，通过五个应用阶段的划分，介绍生物材料3D打印技术的发展现状及相关内容。
　　1.2生物材料3D打印技术简介
　　1.2.1　3D打印技术的基本概念与原理
　　3D打印是基于数字模型，通过计算机控制将材料逐层堆积，制造出3D实体的技术。3D打印的基本思想源于19世纪末一种分层制造地貌地形图的方法，自20世纪80年代科学家提出快速原型（rapid prototyping，RP）制造构想，先后诞生了立体光刻（stereo lithography，SLA）、熔融沉积（fused deposition modeling，FDM）、实体平面固化（solid ground curing，SGC）以及叠层实体制造（laminated object manufacturing，LOM）等工艺技术及商业化设备。进入21世纪，随着学科交叉融合的发展，3D打印作为下一代制造技术的代表，引起了广泛的关注，除了传统原型制造，在复杂金属零件、组织及器官制造等方面都显示出巨大应用潜力。
　　目前用以描述该类技术的概念主要有快速原型、增材制造和3D打印，其中快速原型是从原型制造这种应用场景出发，强调了该类技术的快速制造特性；增材制造是从制造科学的角度对这类技术的概括，有别于传统减材制造（如车削、铣削等）和等材制造（如锻造、铸造等）；3D打印是一个形象而通用的描述，表达了3D结构成形的关键特征。本书所涉及的生物材料3D打印，是指以生物材料为原材料，采用增材制造思想，制造用于生命科学研究与应用的有生命或无生命的生物学产品的技术。它是生物制造（biofabrication）的重要内容之一，强调了以3D打印为工具手段进行生物材料加工制造的特性。
　　3D打印过程涉及三个核心要素：打印机（装备）、打印墨水（材料）以及建模-控制软件。3D打印的核心思想是“离散-堆积”制造，它也概括了该技术的两个重要环节（图1-1）。离散指的是对墨水材料进行离散化处理，用以进一步形成基本构筑单元进行堆积制造，根据材料的不同属性和特征，常见的离散化状态包括粉末、均相溶液、高分子单体等。离散化过程主要体现在原材料制备上，更为关键的环节是如何将离散化材料进行堆积。堆积过程的本质是根据材料的性质，采用一定的能量输入，结合机械结构的运动，实现可控层厚的离散材料的固化以及逐层堆叠。这里的能量输入涉及声（声波等）、光（激光、紫外光、双光子等）、电（电子束等）、热（热气泡喷射等）、力（电动推挤、压电喷射、交变滞惯力喷射等）等方面，它们的作用方式主要分为两类：直接对离散材料进行位置操控以及间接使离散材料实现可控局部固化。例如，典型的熔融沉积制造通过机械推挤，将离散的熔融高分子材料挤出并沉积到相应的位置，实现自下而上的三维实体制造。在立体光刻技术中，激光聚焦在一定层厚范围内，通过在层内进行可控的位置扫描将光固化树脂固化定型。从材料角度考虑，离散墨水的固化是结构成形的关键，这里的固化广义地概括了由离散到聚集的过程，除了传统的“液相-固相”变化（如高分子树脂的光固化、水凝胶材料的凝胶反应），还包括粉末（金属、陶瓷等）材料的烧结和黏结。
　　图1-1 3D打印“离散-堆积”制造基本原理
　　1.2.2 用于3D打印的生物材料简介
　　随着3D打印技术的发展，越来越多的生物材料被应用于制造个性化的复杂3D模型，直接或间接地应用于生物医疗及生命科学领域。当前用于3D打印制造的生物材料包括金属、陶瓷、高分子以及由高分子材料分散在水相中形成的水凝胶材料，其中金属、陶瓷及高分子材料主要针对硬组织，而水凝胶则被广泛地应用于软组织的构建。
　　按照是否还有活性细胞来划分，用于生物3D打印的生物材料又可以分为生物墨水和生物材料墨水，其中前者是含细胞或由细胞组成的原材料，后者是无细胞生物材料。*常见的生物墨水是以水凝胶材料包裹细胞及小分子、微纳颗粒等成分所构成的打印原材料，其中水凝胶材料通过成形为细胞提供力学支撑、3D生长微环境，促进细胞生长以及组织形成和成熟[1]。此外，在一些特殊的生物3D打印工艺中，纯细胞（单个细胞悬液或细胞团簇）直接作为原材料进行打印，是一类特殊的生物墨水。
　　1.金属
　　随着金属3D打印技术的快速发展，诸多金属及合金类生物材料被成功地用以制造个性化的3D结构，包括不锈钢、钛合金、钴铬钼合金等。其中用于骨科植入物制造*典型的材料是纯钛及Ti6Al4V合金。纯钛具有极强的抗腐蚀性能，当暴露在氧化性液体环境时可在表面自发地形成一层稳定的惰性氧化层，被认为是*理想的生物相容性金属材料。T6Al4V合金则能提供更高的力学性能，同时兼具良好的抗疲劳和抗腐蚀性能。其他可用于3D打印的生物相容性金属材料包括316L不锈钢和钴铬合金，为了保证打印结构的力学性能和纯度，通常都要求在这些材料的3D打印过程中严格控制氧气含量，一般在惰性气体氛围下进行。常用的金属3D打印技术包括激光选区熔化（selective laser melting，SLM）、激光选区烧结（selective laser sintering，SLS）和电子束自由曲面成形（electron beam freeform fabrication，EBFF）等。
　　2.陶瓷
　　陶瓷材料是一类含无机盐的混合物，*典型的生物陶瓷材料是羟基磷灰石、磷酸钙和生物玻璃，鉴于良好的生物相容性、生化稳定性以及优异的成骨诱导性，它们被广泛地用于人工关节以及齿科植入物的制造。羟基磷灰石是骨组织中的关键成分之一，已被成功地应用于激光选区熔化和激光选区烧结技术中。和金属及高分子材料相比，陶瓷材料通常具有不同的固化机理，烧结后往往具有明显的残余应力，能影响到*终的力学性能和孔隙结构。为了获得致密的陶瓷结构，在3D打印过程中，需要严格考虑铺粉、激光-粉末相互作用、热应力及残余应力等关键因素。此外，残余黏结剂的影响也需要考虑在内，一般可通过体外细胞实验测试其生物相容性。由于陶瓷材料本身具有很大的脆性，黏结剂的使用以及混合其他柔性组分有助于改善其力学性能，比如，研究者将磷酸四钙和聚己酸内酯混合，通过熔融挤出打印，制备具有骨诱导性的多层支架。
　　3.高分子
　　用于3D打印制造的高分子生物材料主要有热塑性塑料以及光固化树脂两类。典型的用于3D打印制造的热塑性塑料包括聚己内酯（PCL）、聚乙烯醇（PVA）和聚乳酸（PLA），它们通常采用熔融挤出打印技术制备组织工程多孔性支架。光固化树脂的3D打印制造主要采用立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）技术，理论上，凡具有光固化特性的高分子前体材料（一般为液态）均可应用于这类3D打印技术。典型的用于3D打印的光固化树脂包括丙烯树脂和环氧树脂以及它们的混合物，其中，聚乙二醇丙烯类材料具有良好的生物相容性，被用以制备高精度的组织工程支架及植入体。
　　4. 水凝胶及含细胞生物墨水
　　水凝胶指的是分散在水相中的高分子链通过物理或化学交联网络所形成的胶类材料，它具有高含水量、可调力学性能等特性，能有效模拟体内细胞外基质的3D微环境，是用于细胞3D培养的主要材料。根据水凝胶材料的来源，重点介绍以下用于生物3D打印的水凝胶材料。
　　（1）动物来源天然外基质材料。这类材料被认为能*有效地模拟体内细胞3D微环境，它们来源于动物体内的细胞外基质（ECM），能为细胞提供生长、分化及组织形成所需的力学及生化环境。比较典型的用于生物3D打印的细胞外基质材料有胶原、纤维蛋白、透明质酸、基质胶、明胶等。其中胶原是人体内*重要的蛋白质之一，几乎占了蛋白质总量的一半。胶原中整合素受体上含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列，能够调整细胞骨架与细胞外基质之间的相互作用，同时起到多种信号通路和细胞功能的信号传导作用。纤维蛋白是一种高度不溶的蛋白质多聚体，是像细针一样的晶状物，其主要来源于血浆蛋白，具有优异的血液和组织相容性。透明质酸是一种天然糖胺多糖，几乎存在于所有的结缔组织中。作为一类天然的细胞外基质材料，透明质酸具有天然的生物相容性，且在很多细胞行为和组织功能中扮演着重要角色，包括细胞迁移、增殖、分化以及血管再生等[2]。基质胶是从富含细胞外基质蛋白的Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肿瘤中提取出的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、肝素糖蛋白，还包含生长因子和金属蛋白酶等，能促进多种细胞的分化以及组织形成。明胶是一种多肽聚合物，由三螺旋结构的胶原部分水解产生。明胶具有良好的生物相容性、强吸水性以及无免疫排斥效应，在体内可以完全降解。明胶是一种典型的温敏水凝胶，它在低温时凝胶，依靠二级作用力（如氢键）形成凝胶网络，在高温（如37℃）时溶胶，具有热可逆性[3]。
　　（2）非动物来源天然水凝胶材料。这类材料以多糖为主，一般具有良好的生物相容性，但通常认为在细胞功能实现及组织形成上不如上述动物来源天然外基质材料。这类材料经济易得，力学性能优异，是一类重要的生物医用材料。常用于3D打印的主要有海藻酸、壳聚糖和琼脂糖。海藻酸是一种从褐藻中提取出来的多糖碳水化合物，类似于天然细胞外基质中的糖胺聚糖，具有良好生物相容性，没有毒性或者致癌性。海藻酸由单糖醛酸线性聚合而成，单体为β-1， 4-D-甘露糖醛酸（M）和α-1， 4-L-古洛糖醛酸（G），M和G单元以M-M、G-G或M-G的组合方式通过1，4-糖苷键相连成为嵌段共聚物[4]。海藻酸钠（sodium alginate）是*常见的水溶性海藻酸盐，它可与二价阳离子Ga2+、Mg2+发生凝胶化反应，交联网络主要通过古洛糖醛酸的钠离子与二价阳离子交换而得。海藻酸钠的离子交联反应迅速（数秒内发生），形成的凝胶结构力学性能好、生物相容性好，被广泛地应用于生物医学工程领域[5]。壳聚糖是几丁质经过脱乙酰作用后的产物，是一种天然的无毒、生物可降解的多糖。由于与体内透明质酸、糖胺多糖等多糖成分类似，壳聚糖被广泛应用于骨、软骨及皮肤组织工程[6]。壳聚糖一般在酸性条件下溶解，并通过调节pH可以进行凝胶反应，反应一般持续几分钟到几十分钟。由于凝胶反应较慢，且力学性能较差，壳聚糖一般与其他墨水材料混合使用。琼脂糖是一种提取自藻类的半乳糖多聚物，琼脂糖水凝胶的交联具有热敏及热可逆性，其羟乙基化作用的程度能影响其溶胶温度[7]。应用于生物3D打印的琼脂糖需要有较低的凝胶温度和溶胶温度（不高于37℃），以保证打印过程中细胞的活性[8]，打印过程一般采用温控型工艺。琼脂糖可以作为一种非黏附性墨水材料，用在3D打印结构中以形成细胞团簇[9]。
　　（3）合成类高分子水凝胶材料。这类材料通过人工合成而来，成分明确，性质可调。目前常用于生物3D打印的主要有聚乙二醇（PEG）、普朗尼克F127（PF127）等。聚乙二醇水凝胶具有生物相容性及较低的免疫原性，常作为医学及非药物产品的赋形剂，已有多款基于聚乙二醇的产品被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床使用。聚乙二醇通过改性可以进行相应的物理性、离子性或者共价性交联，应用于3D打印的主要是可光交联的聚乙二醇材料，包括聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）[10]。这些光交联材料的水溶液的黏度较低，打印时容易流失，挤出成形性能较差，一般同其他墨水材料混合打印并同步或后续光交联以稳定结构[11， 12]。普朗尼克F127是一个商品名，实

目录
总序
前言
第1章　绪论　1
1.1　引言　1
1.2　生物材料3D打印技术简介　1
1.2.1　3D打印技术的基本概念与原理　1
1.2.2　用于3D打印的生物材料简介　2
1.2.3　典型的生物材料3D打印技术简介　6
1.3　生物材料3D打印技术发展现状　9
1.3.1　没有生物相容性要求材料打印　9
1.3.2　生物相容但不可降解材料打印　10
1.3.3　生物相容且可降解可吸收材料打印　10
1.3.4　直接细胞打印　11
1.3.5　构建类器官、微生理系统和体外生命系统工程　11
1.4　生物材料3D打印技术应用现状　11
1.4.1　组织工程与再生医学应用　12
1.4.2　药物检测应用　13
1.4.3　病理模型及疾病研究应用　13
1.5　生物材料3D打印前景与挑战　14
1.5.1　生物材料3D打印的前景　14
1.5.2　生物材料3D打印的挑战　16
参考文献　18
第2章　低温沉积3D打印技术及其在骨和软骨组织工程中的应用　22
2.1　引言　22
2.2　骨、软骨支架的材料与结构设计　23
2.2.1　常用的支架材料　23
2.2.2　支架的材料结构设计　24
2.3　低温沉积制造工艺原理及打印设备　26
2.3.1　低温沉积制造工艺原理　26
2.3.2　低温沉积3D打印设备　30
2.4　低温沉积3D打印技术应用：骨与软骨组织工程　37
2.4.1　修复大段骨缺损　37
2.4.2　梯度支架修复骨软骨缺损　39
2.5　低温沉积3D打印的拓展：仿生骨软骨支架　41
2.5.1　仿生骨软骨支架设计　41
2.5.2　仿生骨软骨支架制备　42
2.5.3　仿生骨软骨支架修复动物关节缺损　43
2.6　总结与展望　45
参考文献　46
第3章　微挤出式细胞3D打印技术及应用　49
3.1　引言　49
3.2　微挤出式细胞3D打印技术及生物墨水概述　49
3.2.1　微挤出式细胞3D打印技术　49
3.2.2　微挤出式细胞3D打印生物墨水　50
3.3　微挤出式细胞3D打印的共性技术问题　51
3.3.1　微挤出式细胞3D打印的技术共性特征　51
3.3.2　微挤出式细胞3D打印的技术共性要求　52
3.3.3　微挤出式细胞3D打印的通用性技术策略　55
3.4　典型微挤出式细胞3D打印工艺介绍：温敏生物墨水的打印　56
3.4.1　温敏生物墨水的制备与表征　56
3.4.2　工艺过程设计　60
3.4.3　结构成形性及工艺参数对结构成形性影响　61
3.4.4　生物相容性、工艺参数及剪切力对细胞存活率的影响　66
3.4.5　工艺参数、结构成形性与细胞存活率的耦合　69
3.5　微挤出式细胞3D打印微环境中基本生物学表征　71
3.5.1　微挤出式细胞3D打印细胞活性表征　71
3.5.2　微挤出式细胞3D打印细胞增殖表征　74
3.6　微挤出式细胞3D打印技术应用：胚胎干细胞及多能干细胞3D打印　75
3.6.1　胚胎干细胞及多能干细胞简介　75
3.6.2　打印后拟胚体的形成规律及形态　76
3.6.3　拟胚体的形态定量表征　79
3.6.4　拟胚体的“全能性”保持　81
3.6.5　拟胚体形成方法的比较　82
3.7　总结与展望　85
3.7.1　通用化的解决方案　85
3.7.2　机器学习及智能化控制　86
3.7.3　生物4D打印　86
参考文献　86
第4章　喷墨式细胞3D打印技术及其在皮肤打印中的应用　89
4.1　喷墨打印技术的发展历史　89
4.2　喷墨式细胞打印技术介绍　90
4.2.1　喷墨式细胞打印工作原理　90
4.2.2　喷墨式细胞3D打印工艺　94
4.2.3　喷墨式细胞打印设备　96
4.3　喷墨式细胞3D打印墨水　97
4.3.1　胶原　98
4.3.2　明胶　98
4.3.3　海藻酸钠　99
4.3.4　纤维蛋白原　100
4.3.5　聚乙二醇　100
4.4　喷墨式细胞3D打印的特点与优势　101
4.5　喷墨打印对细胞功能的影响　103
4.6　喷墨式细胞3D打印技术应用：组织工程皮肤打印　106
4.6.1　组织工程皮肤背景　106
4.6.2　喷墨打印构建人工皮肤　107
4.6.3　展望　114
4.7　总结与展望　115
参考文献　117
第5章　熔融微挤压3D打印技术及其在合成高分子材料3D打印中的应用　120
5.1　引言　120
5.2　熔融微挤压打印技术　122
5.3　合成高分子生物材料　126
5.3.1　合成高分子生物材料选取　126
5.3.2　脂肪族聚酯类高分子生物材料　127
5.4　3D打印合成高分子生物材料应用：骨组织工程支架打印　128
5.4.1　组织工程支架制备　128
5.4.2　支架结构表征　131
5.4.3　复合支架打印　132
5.4.4　支架表面改性　133
5.4.5　支架生物学评价　135
5.5　3D打印合成高分子生物材料应用：可降解心血管支架打印　138
5.5.1　心血管支架设计　139
5.5.2　心血管支架制备　141
5.5.3　心血管支架表征　143
5.6　总结与展望　148
参考文献　150
第6章　生物3D打印微纳米纤维及其在角膜组织工程中的应用　153
6.1　引言　153
6.2　生物3D打印微纳米纤维技术简介　154
6.2.1　挤出式3D打印成丝制备技术　154
6.2.2　微流控纺丝　155
6.2.3　静电纺丝　156
6.2.4　近场静电纺丝　157
6.3　生物3D打印微纳米纤维眼角膜支架模型　160
6.3.1　构建角膜组织材料选择　160
6.3.2　角膜的3D打印构建技术　161
6.3.3　角膜的3D打印模型的物理及结构表征　163
6.4　打印角膜支架应用：诱导角膜组织再生　167
6.4.1　拓扑结构及化学因子对角膜基质细胞表型维持的影响　167
6.4.2　大鼠基质内板层移植及评估　170
6.5　总结与展望　172
6.5.1　总结　172
6.5.2　展望　173
参考文献　174
第7章　生物3D打印构建血管化心肌组织结构及应用　178
7.1　引言　178
7.2　3D打印心肌组织技术进展　181
7.2.1　微挤出式打印在心肌组织构建的应用　181
7.2.2　悬浮打印在心肌组织构建的应用　182
7.3　血管化心肌组织的打印　185
7.3.1　仿生结构心肌支架设计　185
7.3.2　心肌支架成形的技术方案　187
7.3.3　牺牲模的材料筛选与3D打印制备　188
7.3.4　仿生心肌支架的成形与参数优化　193
7.3.5　仿生心肌支架的结构形态学表征　195
7.3.6　细胞种植与心肌支架的生物功能评价　198
7.4　总结与展望　202
参考文献　204
第8章　生物3D打印构建体外类肿瘤模型及其应用　207
8.1　三维肿瘤模型发展趋势　207
8.2　肿瘤细胞打印工艺技术介绍　211
8.2.1　引言　211
8.2.2　明胶基温敏水凝胶材料流变性能　212
8.2.3　明胶基温敏水凝胶材料流变特性与细胞存活率的关系　217
8.2.4　明胶基温敏水凝胶材料流变特性与打印成形性的关系　222
8.2.5　小结　225
8.3　生物3D打印体外类肿瘤模型的构建　226
8.3.1　引言　226
8.3.2　生物3D打印技术构建A549类肺肿瘤模型　227
8.3.3　生物3D打印技术构建HeLa类宫颈癌肿瘤模型　230
8.3.4　小结　239
8.4　生物3D打印体外类肿瘤模型的应用：上皮-间质转化特性研究　239
8.4.1　引言　239
8.4.2　3D打印宫颈癌模型及其细胞活性与增殖性评价　241
8.4.3　TGF-β诱导3D宫颈癌模型的EMT过程　242
8.4.4　EMT相关标志物的检测与评价　243
8.4.5　TGF-β阻断剂用于抑制EMT过程　246
8.4.6　小结　247
参考文献　248
第9章　生物3D打印构建体外个性化肿瘤模型及其在抗癌药物检测中的应用　252
9.1　引言　252
9.2　个性化肿瘤模型的生物3D打印工艺技术　257
9.2.1　打印技术及生物材料的选择　257
9.2.2　结构设计及细胞的选择　260
9.3　个性化肿瘤模型的3D打印构建及其生物学特性评价　262
9.3.1　存活率及增殖能力评价　263
9.3.2　肿瘤恶性程度、干性、纤维化指标、入侵及迁移能力评估　264
9.3.3　基因组测序评价　268
9.4　个性化肿瘤模型在药物检测方面的应用　270
9.5　挑战和发展　271
9.5.1　细胞来源的局限性和新材料的应用　271
9.5.2　精准控制和长期培养：自愈性凝胶基底打印和血管化肿瘤模型　272
9.5.3　器官级别的药物反应：3D打印微流控肿瘤模型　273
9.6　总结与展望　275
参考文献　275
第10章　生物3D打印构建异质细胞和异质肿瘤模型及应用　281
10.1　引言　281
10.2　异质性与体外异质细胞模型　281
10.2.1　细胞异质性　282
10.2.2　微环境异质性　282
10.2.3　肿瘤异质性　282
10.2.4　体外异质细胞模型的常规构建技术　283
10.3　体外异质细胞模型的生物3D打印构建Ⅰ：构建技术　288
10.3.1　生物3D打印技术　288
10.3.2　异质细胞打印技术的系统搭建和工艺开发　289
10.4　体外异质细胞模型的生物3D打印构建Ⅱ：体外肿瘤模型构建应用　295
10.4.1　异质肿瘤模型的设计　295
10.4.2　异质肿瘤模型的分步构建工艺　296
10.4.3　异质肿瘤模型的一步构建工艺　297
10.5　体外异质细胞模型应用、材料选择及影响　299
10.5.1　异质细胞模型的应用　299
10.5.2　异质细胞模型的材料选择及影响　300
10.6　总结与展望　301
参考文献　302
第11章　hiPSC细胞3D打印及扩增　308
11.1　引言　308
11.2　hiPSC 3D打印工艺简介　309
11.2.1　hiPSC细胞培养　310
11.2.2　羟丙基甲壳素墨水材料的制备及性能表征　311
11.2.3　hiPSC打印工艺参数的选择　314
11.2.4　墨水组分对hiPSC打印成活率的影响　320
11.2.5　小结　321
11.3　应用：基于细胞打印的hiPSC规模化扩增与团簇形成研究　322
11.3.1　引言　322
11.3.2　hiPSC