第1章白桦形成层表达谱分析及相关基因季节调控
　　1.1 引言
　　木材是国民经济建设和发展中不可或缺的重要工业原料。随着社会经济的飞速发展，木材的使用纷繁变化，无论对其用量还是在其材质方面的要求都不断提高。因此，提高木材产量、改善木材品质对林业工作者而言任重道远。在林业蓬勃发展的历程中，老一辈林学家利用常规育种方法为林木改良做出了卓越的贡献，取得了令人瞩目的成就。但是，采用常规的种源选择和杂交育种方式，育种周期长、工序复杂、受外界影响较大，不易控制，较难取得突破性成果，难以培育出生长速度快且适合不同材性要求的林木新品种。而日益发展的分子生物学育种手段为林木改良提供了一个崭新的途径。应用分子育种技术进行林木材性改良不仅可以缩短育种周期，还可以提高育种的目的性和可操作性。木材形成是一个受基因编码严格调控的复杂生物学过程，利用分子手段对木材形成进行改良，*先必须分析出木材形成过程的关键调控基因并了解这些基因的作用机制，才可以通过改变这些基因的表达，实现材性的改良。而木材的形成即木质部的发生源于维管形成层的活动，对维管形成层细胞的增殖、分化进行分子水平的研究将有助于找到与木材形成有关的关键基因，进一步揭示木材形成的分子调控机制。
　　随着基因组学和功能基因组学的发展，利用其*新研究成果和研究技术，可以从转录组水平或蛋白质组水平成规模分离与维管形成层发育和分化相关的基因。木材形成研究的主要基因组学、功能基因组学工具有：表达序列标签（expressed sequence tag，EST）、cDNA微阵列（ cDNA microarray）分析、cDNA-扩增片段长度多态性（ cDNA-amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP）、增强子 /基因捕获分析、全基因芯片分析及蛋白质组学分析等。另外，拟南芥（Arabidopsis thaliana）也可以诱导产生次生木质部（即木材形成）（Dolan et al.， 1993；Lev-Yadun，1994，1995；Gendreau et al.，1997），因而可以利用此植物生物学研究中*重要模式植物的丰富基因组学资源。
　　白桦（ Betula platyphylla）是东北地区重要的用材树种之一，具有生长快、适应性强和抗逆性强的特点，已经广泛用于造纸工业中，是研究东北地区主要用材树种木材形成分子机制的优良材料，具有重要的育种价值。白桦常规育种方面已经取得了很多重要的进展。有相关研究在此基础上以白桦形成层组织为材料构建了 cDNA文库，获得与白桦木材形成和材质材性相关的基因，为研究白桦木材形成主要过程的分子机理及调控机制及利用分子生物学手段培育优良材质的白桦奠定基础。
　　1.1.1 木材形成的生物学过程及其基因调控
　　木材由维管形成层（ vascular cambium）细胞增殖分化而来。维管形成层向外分化形成次生韧皮部，向内分化形成次生木质部，韧皮部和木质部在维管形成层的两侧不断呈辐射状分化（谢红丽， 2003）。由形成层细胞逐步分化形成木质部细胞需要经过一系列严格的分化程序，其中包括：形成层木质部侧的母细胞分裂、细胞的延伸扩展（衍生细胞不断伸长直至其伸长区的*终大小）、次生壁的沉积（包括纤维素、半纤维素和木质素的生物合成及沉积）、木质化及伴随木质化和细胞壁次生加厚的细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。木材形成过程中每一步的基因表达都严格受环境和发育因子的控制（ Chaffey，1999；Hertzberg et al.， 2001；Yang et al.，2004；Yokoyama and Nishitani，2006）。*终成熟的次生木质部包括木质部薄壁细胞、木质纤维、管状分子（tracheary element，TE）。管状分子在木质部分化过程中发生细胞程序性死亡而失去了细胞核和其他内容物，*后形成中空的管状物而成为导管的一部分。
　　许多树种的树干可以分为边材和心材两个明显不同的区域。边材主要从根部运输水分、矿物质和气体等物质到全身各部分器官，为树木供应水分、能量、矿物质和溶质等，同时也为整个植株提供一定的机械支撑。心材是细胞程序性死亡的结果，仅为植株提供机械支撑作用。
　　1. 形成层原始细胞的分裂及木材细胞的生成
　　形成层原始细胞由两种细胞组成：纺锤状原始细胞和射线原始细胞。纺锤状原始细胞向内分裂生成：轴向管胞、管状分子、木质纤维、木薄壁细胞、树脂（胶）道分泌细胞和阔叶材管胞；向外分裂生成：筛胞（针叶树种）、筛管分子（阔叶树种）、韧皮纤维和韧皮薄壁细胞。射线原始细胞形成射线薄壁细胞、射线管胞（针叶树种）（崔克明，2006）。
　　位置效应诱导了木质部细胞的分化，也就是说是维管形成层及其产生的衍生细胞所处的特殊位置诱导了木质部细胞的分化，即启动了木质部细胞的分化程序。这里的位置信息包括轴向的吲哚-3-乙酸（又名吲哚乙酸，indole-3-acetic acid，IAA，一种生长素）流，径向的物理压力、IAA流与蔗糖的浓度梯度共同诱导了木质部细胞分化程序的启动。其中*重要的可能是 IAA流，是它诱导了形成层细胞的分裂，而形成层细胞平周分裂是典型的分化分裂，也就是说这是木质部细胞分化的**步，因此 IAA就是形成层细胞分裂的诱导信号，就 PCD来说它就是死亡信号。IAA是木材形成的关键调节物质，内源的 IAA在欧洲山杨（ Populus tremula）和欧洲赤松（Pinus sylvestris）的形成层组织中都有分布（Hellgren et al.，2004）。
　　生长素通过控制生长素响应基因的表达来调节各种生长和发育的程序，其中包括生长素/吲哚乙酸蛋白（ AUX/IAA蛋白）和生长素响应因子（ auxin response factor，ARF）（Ulmasov et al. 1997；Rouse et al.，1998）。
　　在初生细胞壁形成时期，细胞通过同步生长（在植物组织的分化过程中，相邻细胞的细胞壁以相同速度生长的现象，使细胞壁相互间能整齐地生长，这是在许多组织中所见到的生长方式）和嵌入生长（在植物组织分化过程中，相邻细胞的细胞壁被在两个细胞之间生出的其他细胞挤进而分开，结果引起细胞壁相互间不协调的生长方式，也称侵入生长）来形成*终的形状（Siedlecka et al.，2008）。
　　因此，维管形成层里能够大量表达编码细胞壁修饰酶类的基因，其中就包括扩展蛋白基因（ expansin）、木葡聚糖内糖基转移酶基因（ XET）、纤维素酶基因和果胶甲基酯酶基因（Mellerowicz and Sundberg，2008）。
　　扩展蛋白是影响细胞伸长和塑性的重要蛋白（ Darley et al.，2001）。它是**个从植物细胞壁中分离出来快速诱导细胞延伸的蛋白（Whitney et al.，2000；Darley et al.，2001）。Gray-Mitsumune等（2008）报道了扩展蛋白能促进茎节间的伸长和叶片扩展。Darley等（2001）发现植物生长的停止伴随着成熟细胞壁扩展蛋白含量的进一步下降。张春玲等（ 2006）从毛白杨形成层 cDNA中扩增出一个 expansin基因家族 α-expansin中的 A亚家族基因，编码的氨基酸序列与芒果（杧果）、欧洲山杨×美洲山杨杂交种、拟南芥和矮牵牛的 α-expansin基因编码的氨基酸序列同源性分别为 91%、88%、86%和 86%。有研究表明，杨树中的叶分泌性纤维素酶基因 PopCel1刺激叶的细胞伸展（Hertzberg et al.，2001；Ohmiya et al.，2003）。
　　2. 次生壁的形成
　　次生壁的形成发生在木质部细胞径向生长结束之后，次生壁是由纤维素微纤丝彼此平行排列，加上木质素、半纤维素、果胶及蛋白质等物质协同合成和沉积构建而成。伴随次生壁加厚，有关细胞壁木质化的各种酶活性明显提高。
　　木本植物细胞壁主要由纤维素组成。纤维素的基本单位是 D-吡喃葡萄糖，以 β-1，4糖苷键相连，其葡萄糖残基为 2000～2500个。植物中的纤维素主要是以小微纤丝的形式存在，一般微纤丝是由 36根 β-1，4糖苷链结晶而成，它是植物细胞中的主要成分（李春秀等， 2005）。纤维素生物合成机制包括糖基转移酶将数千的葡萄糖残基合并成长链的程序（ Paux et al.，2004），如图 1-1所示。纤维素微纤丝是次生壁的主要成分之一，由位于质膜上的莲座状纤维素合酶复合体合成（Mueller and Brown，1980；Brett，2000）。目前，在拟南芥中发现至少 10种纤维素合酶基因和 30种类纤维素合酶基因，而且均为含 A型催化域的 CesA基因（Richmond and Somerville，2001）。其中至少有两个基因（ RSW1和 RPC1）在初生壁的生物合成中起重要作用（ Arioli et al.，1998；Fagard et al.，2000）；IRX3和 IRX1在次生壁的生物合成中起作用（ Taylor et al.，1999；Turner et al.，2001）。拟南芥中 AtCesA7基因的突变导致了纤维素产量的下降（ Zhong et al.，2003）。有研究者从松树（ Allona et al.，1998）和杨树（ Wu et al.，2000）等木本植物的木材形成组织中克隆了 CesA基因。杨树基因组中至少有 18个纤维素合酶基因已经被鉴定（Djerbi et al.，2005）。其中 PtCesA2在次生壁形成过程中的木质部细胞中特异表达，而在韧皮部纤维中不表达（Wu et al.，2000），说明了不同的 CesA基因可能有其特有的表达模式和功能。这些纤维素合酶基因在纤维素生产中的生物途径已经被鉴定（ Williamson et al.，2002）。李春秀等（ 2006）以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合酶基因（ PtoCesA1），序列分析表明该基因序列为 3215bp，与欧洲山杨的 PtCesA1基因同源性为 97%。
　　图 1-1 纤维素生物合成途径
　　Glc[Glc]n木质素是次生壁内的第二大组成成分，是一类复杂的酚类物质聚合体，是维持维管细胞壁强度的成分之一。木质素主要沉积在木质部导管和厚壁组织及韧皮纤维中，从而使细胞壁机械强度和不透水性等特性发生重大变化，在植物体的机械支撑、水分运输和病原防御中起重要作用。木质素的生物合成途径已经被详细阐述（ Hertzberg et al.，2001；Williamson et al.，2002；Boerjan et al.，2003；陈永忠等，2003；Mellerowicz and Sundberg，2008）：*先进行单体的合成，然后被运输到细胞壁并*终被聚合成结构分子（ Hatfield and Vermerris，2001；Boerjan et al.，2003），*后在已次生加厚的导管分子和射线细胞中发生木质化（ Murakami et al.，1999）。
　　已经确认的木质素有三种类型：紫丁香基（ S）木质素、愈创木基（ G）木质素和对羟基苯基（ H）木质素，产生哪一种完全取决于木质素聚合物是来自 p-香豆醇（ p-coumaryl alcohol，H）、松柏醇（ coniferyl alcohol，G）还是芥子醇（ sinapyl alcohol，S）。单子叶植物含有上述三种木质素的混合物，但以 H木质素含量*高。而硬木基本上没有 H木质素，针叶树没有 S木质素，石松植物的木质素成分与针叶树相似，而蕨类植物主要含有 G木质素和 S木质素。硬木中的 G木质素往往在导管分子内，而 S木质素在纤维中储量*丰富。