第1章绪论
1.1 引言
使用可视化技术对材料结构、物理化学过程及生物过程进行成像研究是探索其内在机制*直观的方法[1-5]。改善可视化图像的对比度能够获得更精细的结构信息和更准确的动力学过程。近年来，具有高对比度图像的荧光可视化技术已成为可视化领域中发展*快、应用*广的技术之一[4，5]。荧光图像的高对比度来自荧光团发出的荧光信号与周围暗场背景之间的显著差异。因此，开发具有高发光效率的荧光团产生强荧光信号、构建先进可视化系统捕获处理荧光信号，是提高成像分辨率和灵敏度的关键。
早期的荧光可视化方法是使用紫外光激发荧光团，并用裸眼观察荧光信号的产生或猝灭，从而实现对外部刺激的视觉感知。由于裸眼无法感知紫外光，因此激发光源的光辐射背景在视场中表现为暗场，与荧光信号形成鲜明对比。随着不同类型的荧光团被相继开发出来，激发光源的波段从紫外区域扩展到了近红外区域。与之相匹配的荧光可视化技术，需要设计合理的光路对激发光和发射光进行有效的分离，才能拓宽荧光可视化的实际应用。随着仪器制造的发展，荧光显微镜可视化技术应运而生。这项技术优化了光路并解决了光谱学问题，同时，它还具有显微成像功能，使得观察材料微观结构中的荧光信号成为研究热点。早期的荧光显微镜技术可以借助宽视野荧光显微镜获得微米级的荧光可视化信息，但是不能排除非焦平面荧光信号的干扰，导致图像的对比度难以达到微观可视化的要求[5]。通过将针孔结构引入光路，发展出激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM），所获取的荧光图像的分辨率可以提高到200nm。进一步使用步进电机控制CLSM的扫描高度，可以获得垂直方向的荧光图像切片，通过三维重构技术能够无损地实现三维结构可视化。这些功能使研究人员能够更深入地分析材料的结构信息，并将荧光可视化的应用前景推向新的高度。之后，超高分辨率显微镜的出现将荧光可视化技术的分辨率提高到30nm甚至更小尺度，与电子显微镜的分辨率水平相接近[6]。
目前，荧光可视化技术不仅成为化学和生物学领域的主要研究方法，而且在材料科学和工程领域也逐渐显现出非凡的应用潜能[4，5]。自2001年聚集诱导发光（AIE）的概念被提出以后，研究者已经开发了数千种AIE荧光材料，以满足特定的成像分析与可视化需求[7-9]。与传统荧光团相比，AIE荧光团具有非平面的分子构象和独*的光学性质。大多数的传统荧光团通常只能在低浓度下工作，用以避免聚集导致猝灭（aggregation-caused quenching，ACQ）的问题；而AIE荧光团在低浓度时往往处于无荧光状态，当高浓度形成聚集体时产生强荧光。更有意思的是，通过吸附、包被、自组装等方式将低浓度的AIE荧光团制备成聚集体时，可以获得高发光效率和高光稳定性的AIE纳米粒子。优异的光学性质和生物相容性使得AIE荧光团在荧光可视化方面备受青睐。在本章内容中，首先对常用可视化技术的工作原理、发展历史和现状进行简单介绍，重点突出荧光可视化技术。随后，围绕荧光团和荧光可视化技术两个部分进行展开。对于荧光团，主要概述了荧光产生的物理学基础、荧光团的激发和发射光谱、AIE现象和原理、荧光标记的类型和注意事项等；对于荧光可视化技术，主要讨论了宽场荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜的光路构造和成像特点，并选择一些有代表性的例子介绍了AIE分子及其制备的AIE纳米粒子在显微成像中的应用概况。
1.2 显微可视化技术分类
显微镜，特别是光学显微镜一直是提升人类视觉能力的首要工具。在19世纪末，Ernst Karl Abbe提出光学显微镜的极限分辨率由入射光的波长（大约0.5μm）所决定[1]。之后，科学家为了突破光学显微镜分辨率的极限，陆续开发出了电子显微镜、原子力显微镜（atmic force microscope，AFM）、超高分辨率显微镜和纳米显微镜等先进显微可视化系统。为了更好地理解和运用可视化技术，有必要了解各种可视化技术的发展历史、工作原理和现状。结合本书所讨论的对象，对电子显微镜和原子力显微镜两个类别进行概述，着重讨论荧光显微镜（包括传统的宽视野荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和超高分辨率显微镜等）。
1.2.1 电子显微镜
电子显微镜，作为一种重要的成像分析工具，能够在原子尺度提供关于位置、性质甚至是价原子的相关信息。PaulDirac提出了波粒二象性之后，HansBusch展示了磁场可以使电子束偏离或聚焦的技术，Ernst Ruska和Max Knoll利用该技术于1931年首次在自制仪器上实现了17倍的放大倍数[10]。在随后的两年时间内，ErnstRuska改进的电子显微镜可以获得50nm的分辨率。电子显微镜分辨率的提升在第二次世界大战后得到迅速发展[1]：20世纪50年代中期，实现了大约1nm的晶格分辨率；20世纪70年代初，出现了重金属原子（如钚和金）的原子分辨率图像，引发了在原子尺度进行缺陷研究的热潮；到世纪之交，大多数商用电子显微镜的分辨率能达到0.1～0.2nm。
随着研究热点转向纳米材料，研究人员需要在低压加速的条件下获得原子尺度的结构信息。球差校正技术应运而生，这使得透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的分辨率不再受限于棱镜质量，而是由原子本身的静电势和热运动所决定[11，12]。现在，球差校正透射电子显微镜（spherical aberration corrected TEM，STEM ）可以在40keV或更低的加速电压下实现亚埃米分辨率，电子能量损失能谱（electron energy loss spectroscopy，EELS）和能量色散X射线谱（X-ray energy dispersive spectrum，EDX）模式下也可以获得相同水平的电子信息[13]。但是，对于三维物体，大多数电子显微镜图像是其在二维平面的投影，导致可视化结果与实际情况出现偏差。例如，对集成电路中原始微结构的探究，必须获取到材料的三维形态、结构组成和物理特性。为了解决这个问题，通过引入数字图像采集技术、提高对不同电子光学或样品条件下图像的采集能力，发展出可以对纳米结构和化学成分进行三维分析的电子断层扫描和电子全息技术（图1-1）[14-17]。
1.2.2 原子力显微镜
原子力显微镜利用探针扫描固体表面，以获得具有原子级分辨率的表面信息，从而实现微观尺度的生物量和非生物量的可视化研究[18-21]。原子力显微镜具有优越的可操控性，能够在组织、细胞、病毒、蛋白质、核酸和生物材料的表面建立适当的可视化系统[22-24]。此外，原子力显微镜可以在亚纳米级到微米级的生物界面进行高信噪比成像，同时定量分析并呈现被测物体的物理、化学和生物学性质，如实时检测配体与受体之间的键合过程，评估抗体的抗菌作用，定量分析分子、细胞和组织之间的相互作用及描绘生物分子在界面反应中的自由能分布[25-28]。
原子力显微镜的主要成像原理是用配有分子水平探针的悬臂扫描样品表面，利用探针的可伸缩性对样品表面进行轮廓分析并获得可视化图像[19]。由于样品表面在分子尺度上通常是褶皱的，因此需要将激光束从悬臂的背面投射到位置敏感的光电二极管上，通过这种方式使悬臂倾斜并改变探针的位置［图1-2（a）］。位置信息由反馈系统读取，然后通过改变作用力来控制探头和待测样品之间的垂直高度。在早期的原子力显微镜成像过程中，操作人员需要经常调整成像作用力和成像条件，以避免非均相生物表面变形。现代的原子力显微镜控制系统可以准确有效地控制作用力，避免样品变形和损坏[24，28]。随后，通过成像系统将探针在离散点处获得的高度数据可视化为样品的地形图。这些可视化图像的分辨率可以达到纳米级，因此可以使用此方法观察一系列原生生物系统，包括细胞膜、病毒、原纤维、核酸和蛋白质［图1-2（b）～（f）］[29-33]。
1.2.3 荧光显微镜
人类的眼睛依靠色彩的对比度去感知世界。为此，各种创新性方法被发展出来增强显微图像的对比度，为可视化技术在生物学和材料科学领域的应用开辟了新天地[34]。通过使用合适的染料对样本进行特异性染色，就可以在裸眼和光学显微镜下观察到具有高对比度的样本结构信息。以生物组织样本为例，*早是由意大利的生理学家Camillo Golgi和西班牙的病理学家Santiago Ramony Cajal完成染色和显微成像的，该成果于1906年获得了诺贝尔生理学或医学奖[35]。随后，荷兰科学家FritsZernike提出相衬概念，使得不染色观察亚细胞结构成为可能，该成果于1953年获得诺贝尔物理学奖[36]。为了显示出待测物体的三维结构，波兰科学家JerzyNomarski发明了差分干涉对比技术，将入射光分成两个间隔很近的偏振光束（偏振面彼此垂直），当它们穿过样品时，引起的干涉可以产生高度差呈现可见的颜色和纹理变化[37]。此外，利用光穿过待测样品时偏振特性的变化，发展出偏光显微镜[38]。
目前，基于荧光染色的可视化技术是获取高对比度图像的*高效方法。顾名思义，荧光染色是使用荧光染料对样本进行染色，通过吸收特定波长范围内的激发光而发射出更长波长的荧光，其吸收和发射波长范围可以从紫外（UV）光到近红外（NIR）光区域。荧光染色由于对待测样本是特异性标记和点亮，因而具有高的对比度、灵敏度和特异性。在荧光染料发展上，荧光蛋白的使用是一项革命性创新，直接导致了许多荧光显微镜技术的诞生，促进了光学显微镜和细胞生物学的快速发展（图1-3）[39]。Osamu Shimomura、Martin Chalfie和钱永健（RogerY.Tsien）因“发现和开发绿色荧光蛋白”而获得了2008年诺贝尔化学奖[40]。另外，随着荧光可视化技术的飞速发展，逐步诞生了CLSM和超分辨率荧光显微镜等可视化技术[34]。Eric Betzig、Stefan W.Hell和William E.Moerner因“发展超分辨率荧光显微镜”于2014年被授予诺贝尔化学奖[6]。
1.3 荧光显微可视化的成像优势
1.3.1 高对比度
高对比度对于可视化的重要性是不言而喻的。以自然现象为例，在日光照射下，几乎不可能在草丛、灌木和树林里观察到萤火虫；但是，在夜间则可以清楚地看到发光的萤火虫。无论是白天还是黑夜，萤火虫发出几乎相同的光，能否可视化的关键在于萤火虫周围的背景是亮色的还是暗色的。类似地，在光学显微镜下观察特定的样品时，样品与背景之间的对比度越高，越容易观察到清晰的图像。荧光可视化技术使被荧光分子标记的待测样品受激发后发光，以非荧光分子为主的周围环境显示为黑色背景，从而实现高对比度成像（图1-4）。
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