**章 植物细胞工程的理论基础和应用
植物细胞工程是在植物组织培养和植物细胞融合技术等基础上发展起来的一门实验性、实践性、综合性较强的新兴学科，是现代生物技术的重要组成部分，也是现代生物学研究的重要技术手段，其涉及许多理论原理和实际操作技术，是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。
随着现代遗传学、分子生物学和细胞生物学的快速发展，植物细胞工程的发展也十分迅速，在植物细胞工程基础理论和实际应用方面都取得了令人瞩目的成就，这些成就都与研究方法的改进和实验技术的革新密切相关。现在，人们可以利用细胞融合和DNA重组等现代生物技术在细胞和分子水平改良现有品种，甚至创造新品种。因此，植物细胞工程越来越引起科学工作者的重视。
**节 植物细胞工程的概念和应用
植物细胞工程对现代人们生活的影响越来越大，为了使植物细胞工程能更好地为人类服务，了解和掌握其概念及应用显得十分必要。
一、植物细胞工程的概念及其主要技术
（一）植物细胞工程的概念
植物细胞工程（plantcell engineering）是生物技术中的重要分支，是指在植物细胞水平上进行的遗传操作，是现代遗传学、植物细胞生物学、植物发育生物学和分子生物学的一个复杂集合体，它是以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，是以植物组织培养和细胞的离体操作为基础的实验性很强的一门新兴学科。细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏是植物细胞工程的上游工程，而将已转化的细胞应用到生产实践中，以生产生物产品的过程是植物细胞工程的下游工程。
（二）植物细胞工程主要技术及其研究的重要领域
植物细胞工程所涉及的技术很多，主要包括植物组织与细胞培养、植物细胞大批量培养、植物细胞融合、植物染色体工程、植物细胞器移植、DNA重组与外源基因导入、细胞保藏及以上技术与物理、化学技术的结合等。其中细胞培养技术是细胞遗传操作和细胞保藏技术的基础，而细胞遗传操作是植物细胞工程中*具挑战性也是*为重要和关键的步骤，它依赖于植物细胞工程发展过程中基础理论原理、技术操作和仪器设备的发展。
植物细胞工程技术可为生物科学的基础研究提供重要的技术手段，主要表现如下。
1）离体培养的器官发生和体细胞胚状体发生与调控是研究植物形态建成的实验技术体系，促进了植物发育生物学的发展。
2）植物薄层细胞培养技术已成为研究离体条件下植物再生、生理生化和遗传转化的技术体系。
3）利用离体培养技术研究花器官发育，已在多种植物上实现了试管内开花和结实。
4）原生质体培养是单细胞研究的良好技术体系，已在植物细胞分裂、基因表达、核质关系、细胞壁生物学、植物激素的作用机理、物质跨膜运输等领域得到广泛应用。
5）利用离体突变技术分离和鉴定与植物发育有关的基因，为揭示植物遗传与发育调控的分子机理奠定基础。
6）利用花药离体培养加倍单倍体技术获得纯系，可用于有性繁殖植物遗传分离群体的构建，为遗传图谱的构建、基因定位提供稳定的基础材料。
7）建立高效的植物再生体系是植物细胞工程研究的重要领域，是实现植物遗传转化的基础。其中，植物激素诱导的信号传递在细胞分裂、极性确定、器官分化、胚状体的发育等离体培养过程中起重要调控作用。
8）植物组织培养技术为植物矿质营养、有机营养代谢和植物病理学等研究提供了技术手段。
9）植物离体受精技术是植物细胞工程的重要实验技术，为研究植物胚状体发育机理提供了技术手段，也为研发新的植物转基因途径提供了可能。
二、植物细胞工程技术的应用
通过植物细胞工程改良作物是20世纪70年代以后农业科学中*重要的发展之一，对了解、操作、修饰和保护农作物种质具有潜在价值。20世纪70年代以后，随着生物技术和分子生物学的发展，植物细胞工程备受重视，并开始应用于作物品种改良。但对于体细胞无性系变异的存在，曾经有过怀疑和争论，焦点在于这种变异有无遗传基础，后代能否稳定遗传，在作物品种改良中有无实际应用价值。直至20世纪90年代初，随着研究手段的提高，大量研究证明，体细胞无性系变异确实存在并可以遗传，可应用于作物品种改良，并且在有些作物上获得成功，如小麦（胚培养和细胞培养）、水稻（原生质体培养）、大豆（原生质体培养）等。不断有许多成功的实例应用于生产，进展速度比过去预期要快，但困难和障碍仍有待克服。随着科学发展和人们对生命科学的深入探索，植物细胞工程技术在农业、工业、资源保护和利用等领域将发挥重要的作用，如应用于花卉和苗木离体快速繁殖、植物新类型的创造和品种改良及次生代谢物质生产等领域；其与植物遗传育种相结合，如花粉单倍体育种、细胞突变体筛选、植物茎尖脱毒培养和快速繁殖及植物体细胞胚状体发生与人工种子生产等，直接为植物的遗传改良服务；植物细胞工程技术与次生代谢物质的生产相结合，可以为药物生产服务。
植物细胞工程在植物品种改良和次生代谢产物生产及脱毒培养等中的应用具有很多优点，尤其是在作物品种改良中的应用，其与传统育种方法相比具有如下优点：①应用植物细胞工程进行作物品种改良可以省时省力；②进行品种改良可以更有的放矢；③可供选择的变异范围广；④可作为拯救远缘杂交**胚发育的手段。但由于传统育种方法可以为植物细胞工程技术的应用提供变异基础，因此植物细胞工程手段必须与传统育种方法相结合才更有生命力。
植物细胞工程的应用主要有以下几个方面。
（一）胚、胚珠、子房和胚乳及离体受精克服远缘杂交不育性，扩大遗传变异范围
植物胚、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术广泛应用于植物胚状体发育机理，克服杂交不亲和性，胚拯救，克服珠心胚的干扰及打破种子休眠等方面的研究，并缩短植物育种周期，获得体细胞胚和人工种子，建立植物高效再生体系，并在农作物、园艺植物、林木和药用植物上得到广泛应用。
幼胚培养作为解决种间、属间等远缘杂交中**胚停止发育问题的手段已在许多作物的远缘杂交育种中广为应用。早在20世纪20年代，Laibach（1925）通过培养亚麻种间杂交形成的幼胚成功地获得了**，从而开创了植物胚状体培养的先河。其后，20世纪30年代，不少人在果树胚状体上做了很多工作，所培养的胚都较大。LaRue（1936）通过研究认为，小于0.5mm的胚的培养不能成功。从20世纪40年代起，人们对离体幼胚培养中的营养需要进行了大量研究，主要是在培养基中加入椰乳、麦芽提取液等物质，从而使培养心形期或比心形期更早时期的胚（0.1～0.2mm）获得了成功。我国胚培养（简称胚培）开始较早，但主要用于裸子植物。1949年后，中国科学院植物研究所、遗传与发育生物学研究所和北京大学相继开展这一工作，并取得一定进展，如大麦和小麦**幼胚、小麦和山羊草胚培养等。东北农业大学小麦研究室自1983年以来也开展这一工作。胚培养成功地用于远缘杂交育种和种内杂交育种实践，同时胚培养技术也广泛地用于研究胚状体发育和与胚状体发育有关的内外因素，以及与其发育有关的代谢生理生化变化。
在胚状体发生初期就停止发育的胚，不但取胚困难，而且对培养条件要求很高，但通过胚珠培养或子房培养可以获得完全成熟的种子。
胚乳培养可应用于获得具有利用价值的三倍体植株。我国已在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、猕猴桃等10多种植物上获得了胚乳再生植株。此外，胚乳培养还可提供研究淀粉等营养物质合成和代谢的实验体系。
植物离体受精通过离体柱头授粉、离体子房授粉和离体胚珠授粉等方法实现，可以用于克服植物授粉不亲和的问题，同时也可以进行胚状体、种子和果实发育机理等的基础研究。Kanta（1963）直接将花菱草等植物的花粉散布在置于培养基上的未受精胚珠上，受精成功。随后，中国科学院西北高原生物研究所在小麦和烟草等作物上进行的试管授精试验均获成功。这一技术的成功运用使远缘杂交在作物改良中的利用前景更广阔。
（二）离体条件下诱导孤雌生殖、花药和花粉培养进行单倍体育种
雌核发育是植物存在的自然现象，在离体条件下诱导未受精的子房和胚珠，或者在活体条件下通过授以不同种类的花粉或经辐照等物理方法处理的花粉，诱导产生雌核发育，产生单倍体植株，已在小麦、水稻、玉米、甜菜、向日葵、马铃薯、西葫芦、洋葱、黄瓜、非洲菊、百合、小黑杨、三叶橡胶、烟草、矮牵牛等10多种植物上获得成功。
利用花药、花粉培养（简称花培）育成的单倍体植株，经过染色体加倍，可在短期内育成遗传变异稳定的株系，有利于缩短育种年限，已在小麦、大麦、水稻、烟草、玉米、辣椒等250多种植物上获得成功，中国、加拿大、澳大利亚、欧盟等在花培育种方面取得了突出的研究成果。我国花培在20世纪70年代后发展迅速，处于****地位，并*次成功获得小麦花药培单倍体植株，培育出许多有实用价值的品种，如冬小麦‘京花一号’、水稻‘单丰1号’、水稻‘中花9号’、油菜‘华油一号’和烟草‘单育1号’等。我国的花培技术日趋完善，虽然研究单位在减少，但工作逐渐深入，如利用花培中产生的异源代换系和附加系等材料进行遗传学和细胞学方面的研究，并在实际应用中将花培与常规育种技术密切结合。
（三）原生质体融合产生体细胞**，扩大遗传变异范围
通常在受精时可以看到细胞融合，雌雄配子体融合而形成合子，但在远缘植物及无亲缘关系的植物间，甚至动植物间，这种生殖细胞的融合困难很大，甚至完全不可能，但通过体细胞融合技术就可以克服有性杂交不亲和性，创造新的物种或类型，实现植物种间、属间或科间的体细胞杂交，如番茄×马铃薯、甘薯栽培种×野生种、甘蓝×白菜、拟南芥×甘蓝型油菜、酸橙×甜橙、红橘×枳壳的**培育等。利用细胞融合技术，还获得了一些特异的新种质，如细胞质雄性不育水稻、细胞质雄性不育烟草等。典型的例子是1978年Melchers将番茄叶肉细胞与马铃薯块茎组织细胞融合获得新的体细胞融合**，这种植物虽然不结果，但可形成薯块，说明通过细胞融合可以创造出新的体细胞**。但目前成功的实例不多，有实际应用价值的实例尚未出现，体细胞融合过程的细胞学方面研究资料尚显不足，远缘不亲和性及属科间**细胞分化等问题仍未克服。此外，融合产物中存在两个亲本的两套遗传物质，比有性杂交更为复杂，细胞器和基因组间的相互关系，以及它们之间发生重组或排斥的机理尚不清楚，尽管目前已在多种植物上建立了体细胞杂交和遗传操作的技术程序，但还有相当多的植物在原生质体培养上存在技术困难，仍需进一步加强多学科的交叉研究及技术集成和创新。
（四）植物快速繁殖技术的应用
无性系的快速繁殖（简称快繁）在20世纪70年代未受到应有的重视，80年代后才逐渐成为热门，原因在于它可以直接产生经济效益，且操作比较容易。由于组织培养繁殖植物的突出特点是快速，因此对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”植物品种的繁殖意义更大，并在高附加值经济植物、珍稀濒危植物、转基因植物、育种原种及植物脱毒苗培育方面得到广泛应用。
在脱毒方面，植物脱毒和离体快速繁殖技术是目前植物细胞工程中应用*多、*有效的一个领域，在发达国家和发展中国家均有商业化应用，且联合国粮食及农业组织（FAO）将这一技术作为成本效益高效型技术向发展中国家推广。在农业生产中，许多农作物都带有病毒，无性繁殖的植物如马铃薯、甘薯、大蒜等尤为严重，但感病植株并非每个部位都带有病毒。White早在1943年就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。利用组织培养方法进行茎尖培养，获得的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗，再用脱毒苗进行繁殖，则不会或极少发生病毒。目前，组织培养技术在甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、马铃薯、兰花、葡萄等植物上已成功应用，且外植体已不仅限于茎尖，侧芽、鳞片、叶片、球茎、根等都可以应用组织培养技术。我国开展植物快繁研究较早，20世纪70年代中期开始规模化植物快繁
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