**篇 生化分离技术
生化分离技术是指从含有多种组分的混合物中将某种生化物质与其他物质分离的技术。
生化分离技术在生物科学与生物工程的基础研究、应用研究和实际生产中是广泛使用、不可缺少的手段。
生化分离技术有多种，本篇主要介绍提取与沉淀分离技术、过滤与膜分离技术、萃取分离技术、层析分离技术、电泳技术、离心分离技术等。
**章 提取与沉淀分离技木
生化物质种类繁多，主要包括各种蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、寡糖、二糖、单糖、脂类、脂肪酸及各种初级代谢物和次级代谢物等。
为了研究各种生化物质的分子结构、功能和各种特性，进行生物科学和生物工程的基础与应用研究，就必须获得高纯度、具有完整结构和生物活性的各种生化物质，特别是各种生物大分子，如蛋白质、核酸、酶等。为此，*先要从生物体的组织、器官、细胞中将它们提取出来，然后再用沉淀分离等各种分离技术进行分离纯化。本章主要介绍各种生化物质的提取与沉淀分离技术。
**节 细胞破碎
生物体内的各种物质种类繁多，存在于生物体的不同部位。除了动物、植物体液中和微生物细胞胞外的某些蛋白质和多肽之外，大多数生物大分子都存在于细胞内部。为了获得细胞内的各种生化物质，就得收集组织、细胞并进行组织或细胞破碎，破坏细胞的外层结构，才能进行生化物质的提取和分离纯化。
不同的生物体，或同一生物体不同组织的细胞，由于结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件不同。必须根据具体情况进行适当的选择，以达到预期的效果。
细胞破碎方法很多，可以分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实际使用时应当根据细胞的特性、生化物质的特性等具体情况选用适宜的细胞破碎方法。有时也可以采用2种或2种以上的方法联合使用，以便达到细胞破碎的效果，义不会影响酶的活性。
一、机械破碎法
通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。常用的破碎机械有组织捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。按照所使用破碎机械的不同，机械破碎法可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法3种。
1．捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织或细胞破碎的方法称为捣碎法。捣碎机的转速可以高达10000r/min。此法常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织或细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。使用时，先将组织、细胞悬浮于水或其他介质中，置于捣碎机内进行破碎。
2．研磨法 利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织或细胞破碎的方法称为研磨法。必要时可以加入精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。研磨法设备简单，可以采用人工研磨也可以采用电动研磨。其中，电动球磨机可以在实验室也可以在工业生产中使用。此法常用于微生物和植物组织或细胞的破碎。
3．匀浆法 利用匀浆器产生的剪切力将组织或细胞破碎的方法称为匀浆法。匀浆器一般南硬质磨砂玻璃制成，也可以南硬质塑料或不锈钢等制成。
匀浆器由一个内壁经磨砂的管和一根表面经磨砂的研杆组成，管和研杆必须配套使用，研杆与管壁之间仅有几百微米的间隙。通常用于破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织或细胞。大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。匀浆器的细胞破碎程度较高，对酶的活力影响不大，但处理量较少。高压匀浆器可在工业化生产中应用。
二、物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织或细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下。
1. 温度差破碎法 利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎的方法称为温度差破碎法。例如，将在18℃冷冻的细胞突然放进热水中，或者将较高温度的热细胞突然冷冻，都可以使细胞破坏。
温度差破碎法对于那些较为脆弱、易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌等，有较好的破碎效果。但是在提取酶时，不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。此法难以工业化生产。
2．压力差破碎法 通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的有高压冲击法、突然降压法及渗透压变化法等。
(1) 高压冲击法是在结实的容器中装入细胞和冰晶、石英砂等混合物，然后用活塞或冲击锤施以高压冲击，冲击压力可达50～500MPa，从而使细胞破碎。
(2) 突然降压法是将细胞悬浮液装进高压容器，加高压至30MPa甚至更高，打开出口阀门，使细胞悬浮液迅速流出，出口处的压力突然降低到常压，细胞迅速膨胀而破碎。突然降压法又称为爆炸式降压法，是将细胞悬浮液装入高压容器，通入氮气或二氧化碳，加压到5～50 MPa，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。
突然降压法对细胞的破碎效果取决于下列几个因素。①压力差：一般压力差要达到3MPa以上，才有较好的破碎效果。②压力降低速率：压力降低得越快，破碎效果越好，压力若在瞬间骤降，可以达到爆炸性效果。③细胞的种类和生长期：此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的破碎效果较佳，*好使用对数生长期的细胞。
(3) 渗透压变化法是利用渗透压的变化使细胞破碎。使用时，先将对数生长期的细胞分离出来，悬浮在高渗透压溶液（如20%左有的蔗糖溶液等）中平衡一段时间。然后离心收集细胞，迅速投入4℃左右的蒸馏水或其他低渗溶液中，由于细胞内外的渗透压差别而使细胞破碎。此法特别适用于膜结合酶、细胞间质酶等的提取。但是对革兰氏阳性菌不适用，主要是由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽多糖组成，可以承受渗透压的变化而不致细胞破裂。
3．超声波破碎法 利用超声波发生器所发出的10～25 kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用(cavitation)而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
超声波破碎的效果与输出功率、破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度、溶液黏度、pH、温度及离子强度等的影响，必须根据细胞的种类和酶的特性加以选择。
超声波细胞破碎的一般操作条件为：频率10～20 kHz；输出功率100～150 W；温度0～10℃；pH 4～7；处理时间3～15 min；为了减少发热，防止温度升高对酶产生不利影响，可以在冷库中进行操作，或者将样品置于冰浴中，并采用间歇操作，如破碎30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。超声波破碎具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。*好采用对数生长期的细胞。
三、化学破碎法
通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，以及特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶变性失活，操作时应当在低温条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎的效果较好，但会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂，如Tween、Triton等。
四、酶促破碎法
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到破碎细胞目的的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
利用细胞本身酶系的作用，在一定pH和温度条件下，保温一段时间，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法称为自溶法。白溶法效果的好坏取决于温度、pH、离子强度等自溶条件的选择与控制。为了防止其他微生物存自溶细胞液中生长，可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。
根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌酶，作用于肽多糖的(β-1，4-糖苷键，而使其细胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加β-葡聚糖酶，使其细胞壁的β-1，3-葡聚糖水解；霉菌可用几丁质酶进行细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合使用，可使各种植物的细胞壁受到破坏，对植物细胞有良好的破碎效果。在酶催化过程中，要根据细胞壁的结构特点选择使用适当的酶，并根据酶的动力学性质，控制好各种催化条件。
第二节 提取
提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离的生化物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程，也称为抽提。
影响提取的主要因素是欲提取物质在所使用的溶剂（溶液）中的浴解度，以及该物质向溶剂（溶液）扩散的速率。一种物质在某一溶剂或溶液中的溶解度大小与该物质的分子结构及所使用的溶剂的理化性质有密切关系。一般来说，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
提取条件对提取效果也有显著影响。通常随着温度升高，生化物质的溶解度增大。在不同的pH条件下，各种生化物质的溶解度各不相同，对于两性电解质而言，在pH为等电点时，溶解度*小。
从细胞、细胞碎片或其他原料中提取蛋白质的过程还受到扩散作用的影响。
为了提高提取率并防止生化物质（特别是蛋白质和核酸）的变性失活，在提取过程中要注意控制好温度、pH等提取条件。
一、提取的方法
根据提取时所采用的溶剂或溶液的不同，提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。现以蛋白质和核酸的提取为例，简单介绍如下。
1．盐溶液提取 大多数蛋白质都溶于水，而且在低浓度盐存在的条件下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。而在盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。所以，一般采用稀盐溶液进行蛋白质的提取，盐的浓度一般控制在0.02～0.5 mol/L的。例如，同体发酵生产的麸*中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，用0.14 mol/L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5 mol/L的磷酸氢二钠溶液提取；6磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1 mol/L的碳酸钠溶液提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1 mol/L的氯化镁溶液提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用不含盐的清水提取的效果较好。
核糖核酸(RNA)隙了常见的转移核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖体核糖核酸(rRNA)外，还有各种小分子核糖核酸(sRNA)。RNA可以采用稀盐溶液提取。一般在细胞破碎制成匀浆后，采用0.14 mol/L的氯化钠溶液抽提，再与蛋白质、多糖、少量脱氧核糖核蛋白等分离而得到RNA。
脱氧核糖核酸(DNA)主要存在于细胞核中，通常以脱氧核糖核蛋白的形式存在。DNA可以采用浓盐溶液提取。一般在细胞破碎制成匀浆后，先用0.14 mol/L的氯化钠抽提除去RNA，再用1mol/L的氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，然后与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质而得到DNA。
2．酸溶液提取 有些生化物质在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。提取时要注意溶液的pH不能太低，即酸的浓度不能太高，以免发生变性失活现象。通常选用pH为3～6进行蛋白质的提取，如胰蛋白酶可用0.12 mol/L的硫酸溶液提取等。
3．碱溶液提取 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的蛋白质，应采用碱溶液提取。例如，细菌L-天冬酰胺酶可用pH 11～12.5的碱溶液提取。操作时要注意pH不能过高，以免影响酶的活
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