实验1 原生动物
【实验目的要求】
(1)学习显微镜下观察活动物的方法，观察并掌握眼虫、纤毛虫的形态结构。
(2)了解鞭毛纲、肉足纲、孢子虫纲和纤毛虫纲的主要特征。
(3)培养识别原生动物的能力，了解疟原虫的生活史和各期的基本形态。
【实验材料与用品】
(1)活的绿眼虫、草履虫。
(2)眼虫装片、草履虫及其生殖装片、间日疟原虫装片。
(3)显微镜、广口瓶、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布、擦镜纸、吸水纸、精密pH 试纸。碘液、10%甲基纤维素、亚甲基蓝、醋酸洋红、NaCl。
【实验内容】
(1)观察活绿眼虫、大变形虫、草履虫。
(2)观察绿眼虫与眼虫的装片。
(3)观察间日疟原虫的各期形态。
【实验方法与步骤】
1. 眼虫及其他鞭毛虫
1)绿眼虫(Euglena viridis)的采集、分离与培养
在200ml广口瓶中放入富含腐殖质的干菜园土20g，加入清水150ml，水面高于土层4~5cm，用棉花塞住瓶口灭菌。或取麦粒8~10粒，加水200~250ml，煮沸10min后过滤冷却，备用。
在腐殖质丰富的静水小河沟、池塘或污水坑中，采到绿眼虫后，在显微镜下，用毛细吸管将绿眼虫分离移出，反复稀释分离多次得到较纯绿眼虫后，接种到备好的广口瓶内，每瓶20~30个。然后，置于温度为15~20℃的温暖光亮的地方，避免日光直射，培养一周后即可得到大量绿眼虫。为什么绿眼虫培养要在无菌条件下进行？ 如果将其置于完全用黑纸包裹的试管中培养，眼点和颜色会出现什么变化？ 你能设计实验证明其颜色变化与光线有关吗？
2)绿眼虫运动的观察
用吸管从培养缸向光侧取一滴含绿眼虫的培养液，置于载玻片上，将盖玻片一端贴水倾斜小心慢慢放下。低倍镜下观察到游动的绿眼虫，鞭毛不断摆动使身体做螺旋状摇摆前进。找一不太活动的绿眼虫，观察因表膜收缩、伸展使细胞变形而形成的绿眼虫式运动。为什么从向光侧取培养液？ 为什么加盖玻片要贴水倾斜慢慢放下？ 绿眼虫是怎样运动的？注意观察瓶中绿眼虫培养液的颜色及其变化，并说明原因。
3)活眼虫形态结构的观察
在低倍镜下观察缓慢移动的眼虫，可看到储蓄泡、伸缩泡和收集泡。眼虫不活动后转到高倍镜下观察。运动的前方为前端。虫体呈梭形，前端钝圆，后端尖削(图1-1)。
图1-1 眼虫结构(华中师范学院等1984；刘凌云和郑光美1998)
鞭毛(flagellum) 从体前端的胞口中伸出。
储蓄泡(reservoir) 胞口后面有一略呈长圆形、无色透明的储蓄泡，通收缩泡(contractile vacuole)。
眼点(sti-ma) 红色，1个，位于储蓄泡前端的一侧、感受器(photoreceptor)的表面，为遮光体(pig mentshield)。
叶绿体(chloroplast) 细胞质内有大量绿色卵圆形的星状结构；细胞内颗粒状半透明小体称为副淀粉粒(paramylumg ranule)。
细胞核(nucleus) 虫体后端约1/3处有一大而圆的核，常被叶绿体覆盖，内含核仁(nucleolus)。在盖玻片一侧加一小滴碘液，用吸水纸在另一侧吸取碘液，将鞭毛染成褐色；另制作一眼虫玻片，加醋酸洋红，细胞核则染成红色。注意将光线调得稍暗些进行观察。眼点有何功能？
4)包囊(cyst)
待观察的制作装片变干时，眼虫停止活动缩成球形，其内可见红色眼点和叶绿体，虫态变化表明将形成包囊；视野内已经形成包囊的个体其虫体圆，不动，虫体分泌一种胶质在外面形成厚壁的包囊。眼虫形成包囊有何意义？
5)眼虫装片观察
梭形，前端钝圆，后端尖削，鞭毛(常脱落)从体前端的胞口中伸出，胞口后有一膨大亮泡，即储蓄泡。细胞质内大量卵圆形的结构为叶绿体，虫体中部稍后大而圆的是细胞核。纵二分裂的虫体从前端分裂；有的能看到包囊。
2. 变形虫及其他肉足纲动物
1)变形虫(Amoeba sp.)的采集与培养
从水中开始腐烂的水草等植物茎叶中可采集到大变形虫。将采集到附有变形虫的茎叶直接置于有水藻的培养缸内培养，两周后可得到大量变形虫和较多的其他水生生物。为得到较纯变形虫，需要将采集到的植物茎叶放入盛水的培养皿内，24h后晃动培养皿并立即倾出水和植物茎叶，用蒸馏水轻轻冲洗培养皿。然后，向培养皿内放4或5粒大米或麦粒，加20ml水，盖好盖，置于温度为15~20℃的温暖光亮的地方，避免日光直射，两周后可得到大量较纯变形虫。
2)变形虫的形态结构观察
用镊子取一块有变形虫的植物茎叶放到载玻片上蘸几下，或者用吸管从培养液底部吸取1滴放在载玻片上，加盖玻片，将光线调暗用低倍镜观察。变形虫虫体小，几乎透明，呈极浅的蓝色；变形虫移动时，虫体不断改变形状。根据这两个特点仔细寻找。找到变形虫后，换高倍镜观察，观察时随动物运动而移动玻片，保持变形虫始终在视野内(图1-2)。
图1-2 变形虫结构及吞噬过程(刘凌云和郑光美1998)
1~4表示吞噬过程
细胞膜(cell membrane) 位于细胞的*外面，其内细胞质明显分为两部分。
外质(ectoplasm) 细胞质(cytoplasm)中的外层透明的部分。
内质(endoplasm) 细胞质中的内层颜色较暗、含有颗粒的部分。
细胞核(nucleus) 内质中央有一个扁圆形、较内质稠密的结构。
食物泡(foodvacuole)和伸缩泡(contractile vacuole) 位于内质中、大小不同的泡状结构，包括吞噬泡(phagocytic vacuole)、消化泡(digestive vacuole)等。伸缩泡是一个清晰透明的圆形泡，时隐时现。食物泡是怎样形成的？ 伸缩泡有何作用？ 它是如何发挥作用的？
伪足(pseudopodium) 变形虫运动时，体表形成临时性的突起，称为伪足。伪足形成时，溶胶质向运动的前方流动，外质向外凸出呈指状，内质流入其中，流动到前端后向外分开，继着变为凝胶质，同时，后边的凝胶质转变为溶胶质向前流动。伪足有哪些类型？ 伪足有哪些功能？
3)痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)
装片观察滋养体(trophozoite)。
大滋养体(big trophozoite) 较大，内有食物泡和细胞核，核居中。
小滋养体(small trophozoite) 较小，内有细胞核。如何区分大小滋养体？
包囊(cyst) 有囊壁包围，内有棒状拟染色质体(parachromatin)，4核包囊是感染阶段。
3. 草履虫的观察
1)草履虫(Paramecium caudatum )采集与培养
将10-干稻草或麦秆剪成长寸许的小段，放入大烧杯中加水1000ml，煮沸30min，停火冷却24h后制成培养液，备用。
在水流缓慢、有机质丰富的污水沟或池塘里一般都可采到草履虫，用滴管吸取表面的水，装进小瓶带回实验室镜检，看到草履虫就可提取纯草履虫放入事先准备好的培养液中进行培养，置于18~20℃培养箱内，培养半月后，可得到大量草履虫。
2)草履虫的形态结构观察
用滴管蘸10%的甲基纤维素在载玻片上涂圆圈后，在中央滴加草履虫液，盖好盖玻片，低倍镜下观察(图1-3)。分辨出前端较圆、后端较尖后，观察运动方向和方式。当草履虫游动缓慢时，转到高倍镜观察以下结构。比较观察不放甲基纤维素草履虫的游动情况，说明为什么要放甲基纤维素？ 能否用棉花、吸水滤纸代替？ 操作方式有何不同？
纤毛(cilia) 长短相近，布满虫体的表膜(pellicle)上，协调一致地不断摆动。观察时，调节光圈使视野中光线减弱一些。
口沟(oralg roove) 在虫体一侧，从近前端斜向后端的凹沟，下通胞咽(cyto-pharynx)，胞咽内有胞口。
食物泡(food vacuole) 虫体内大小不一的泡状结构。吞噬食物(phagocytic vacu-ole)后，加入水解酶，经消化泡(digestive vacuole)运行吸收营养，食物残渣由临时形成的胞肛(cytoproct)排出体外。
伸缩泡(contractile vacuole) 和收集管(collecting canal) 在口沟相反一侧的前、后端，约每隔1min可看到交替收缩的两个透亮的小泡，即伸缩泡。收缩时，其周围出现辐射状的收集管。储蓄泡、伸缩泡和收集泡三者有何关系？
细胞核(nucleus) 生活时不易见到。可再取一滴草履虫培养液，滴一小滴1%醋酸洋红，盖上盖玻片。2~3min后，可看到细胞核被染上紫红色，大核(macronucleg-us)肾形，其凹陷处有一个小核(micronucleus)。注意醋酸洋红用量不要太多。
图1-3 草履虫的结构
3)草履虫应激性的观察
刺丝泡(trichocyst)的发射 取一滴草履虫液加于载玻片上，加盖玻片后，在其一侧滴一小滴亚甲基蓝，在另一侧用吸水纸吸取染液；或者直接将亚甲基蓝滴于培养液上再加盖玻片，草履虫染色后显微镜下可看到，虫体周围刺丝泡中的刺丝放出，呈现放射状的蓝丝。注意不要吸干染液，说明刺丝泡的结构和作用。
对盐度变化的反应 分别在5张载玻片的中左侧滴一滴蒸馏水以及0.1%、0.3%、0.5%、0.7%浓度的氯化钠溶液，在载玻片中右侧各滴一滴草履虫培养液，并用吸管尖端把两滴液体连接起来，镜下观察草履虫的游动及分布情况。10min后加一滴甲基纤维素并盖上盖玻片，在显微镜下观察草履虫伸缩泡的活动，用秒表记录伸缩泡的收缩周期3次，然后，用平均值计算伸缩泡的收缩频率(次数/min)。说明不同盐度溶液中，草履虫的活动、分布情况及伸缩泡收缩频率的变化及其原因。
对酸刺激的反应 在2张载玻片上各滴一滴草履虫培养液，然后，用吸管分别加上一小滴0.01%~0.02%或0.04%~0.06%浓度的乙酸溶液于草履虫培养液中央。在镜下观察草履虫的运动和分布情况，并用pH 试纸轻轻浸入草履虫聚集处和滴入酸液处，测其pH。草履虫对酸度刺激有何反应？ 酸度对草履虫的运动有何影响？
4)草履虫生殖装片的观察
显微镜下观察草履虫横二分裂装片和接合生殖装片。说明繁殖方式的不同及其意义。
4. 间日疟原虫血液染色涂片观察
用油镜观察间日疟原虫(Plasmodium vivax)患者血液染色涂片，红细胞(RBC)是红色圆形的，红细胞内各期疟原虫的细胞质被染成蓝色，细胞核被染成红色。
环状体(ring form 或ring body) 裂殖子进入红血细胞后发育成环状滋养体。个体小，中间有大空泡，核在一边，周围有细胞质。形态像戒指，故称环状体(图1-4)。
图1-4 疟原虫包囊与环状体
裂殖体(schizont)与裂殖子(merozoite) 滋养体细胞核进行裂体生殖形成多个裂殖体，细胞质尚未分裂，裂殖体期的疟原虫充满整个红细胞。接着细胞质分裂包围在每个核周围，形成卵圆形的小个体，称为裂殖子。
大配子(macrogamete) 即雌配子母细胞，充满红细胞，细胞核偏在一边，核质较紧密，疟色素(malarial pigment)颗粒粗大。
小配子(microgamete) 即雄配子，细胞核位于中部，核质疏松，疟色素颗粒细小。
5. 示范标本观察
1)其他鞭毛纲动物(根据实验室条件选用)
杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、
展开
