第一篇细胞工程理论基础
第1章 细胞工程简介
1.1 生 物 工 程
生物工程（bioengineering）也称生物工艺学（biotechnology），是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。
1.1.1 生物工程发展历程
1.1.1.1 第一代生物工程
生物工程的历史非常悠久，可以追溯到几千年前的酿酒。1674年列文 虎克（Antonie van Leeuwenhoek）利用自己发明的显微镜观察到了细菌。1857年巴斯德（Pasteur）证实了酒精发酵是由酵母引起的，从而揭示了发酵的本质。
19世纪末到20世纪30年代，乳酸、酒精、丙酮、柠檬酸、淀粉酶等发酵产品问世，以工业微生物生产发酵产品为代表的生物工程正式诞生了。
1.1.1.2 第二代生物工程
第二代生物工程起源于20世纪40年代第二次世界大战时期。战争需要一种有效而副作用小的抗细菌感染药物。虽然1928年英国人弗莱明（Fleming）发现了青霉素，1940年由弗罗里和钱恩等实现人工提取并经过临床证实青霉素的疗效，但是大规模制备仍未实现。1941年美国和英国合作对青霉素的大规模生产进行研究和开发，建立了青霉素大规模发酵制备工艺。不久，链霉素、金霉素、新霉素等相继问世。抗生素工业的兴起标志着工业微生物生产进入了一个新的阶段。
抗生素生产的经验促进了20世纪50年代的氨基酸发酵工业、60年代的酶制剂工业的发展。
1.1.1.3 第三代生物工程
1953年，美国的沃森（Waston）和英国的克里克（Crick）发现了DNA的双螺旋结构。1974年，美国的波依耳（Boyer）和科恩（Cohen）首次在实验室中实现了基因转移。20世纪70年代，随着基因重组、细胞和组织培养、酶固定化、动植物细胞大规模培养、生物反应器等技术的迅速发展，生物工程进入了新的发展阶段——现代生物工程阶段，为医药、食品、化学、农业及环保等行业带来了新的技术革命。
1.1.2 生物工程与其他学科的关系
生物学、化学和工程学是生物工程*为重要的三门基础学科（图1.1），为生物工程提供理论支撑；生物工程反过来又推动这些基础学科的发展。
1.1.3 生物工程组成
传统的生物工程包括微生物工程（发酵工程）、生物化学工程酶工程、细胞工程、基因工程。后来，蛋白质工程、代谢工程、组织工程等生物工程技术得以迅速发展（图1.2）。
1.1.3.1 微生物工程
微生物工程（microbial engineering）又称发酵工程，是指利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。
微生物工程是*古老的生物工程技术，其对象除天然微生物外，还包括基因工程菌。
1.1.3.2 酶工程
酶工程（enzyme engineering）是利用酶的催化作用，生产人类所需的产品或达到某一特殊目的的技术。
酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，能特定地催化化学反应，具有效率高、条件温和、污染小、能耗低、反应容易控制等特点。
1.1.3.3 生物化学工程
生物化学工程（biochemical engineering）简称生化工程，主要研究将实验室研究成果转化为产品的过程中带有共性的工程技术问题。例如，①生物反应器系统及生产工艺；②分离技术和设备；③生物反应过程的数学模型；④生产过程在线检测和控制。
1.1.3.4 基因工程
基因工程（genetic engineering）是指对生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合，再转入生物体内生产出人们所期望的产物，或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。
基因工程使得人们可以克服物种间的遗传障碍，创造出自然界没有的新的生命形态，以满足人类社会的需要。
1.1.3.5 蛋白质工程
蛋白质工程（protein engineering）是指在基因工程的基础上，通过对基因的人工定向改造，对蛋白质进行修饰或改造，生产出新型蛋白质的技术。由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，因此也被称为“第二代基因工程”。
1.2 细 胞 工 程
细胞工程（cell engineering）是应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。
细胞工程是生物工程重要组成技术，研究对象不仅包括细胞，而且还包括染色体、细胞核、原生质体、受精卵、胚胎、组织或器官等。按照生物类别划分，主要包括植物细胞工程、动物细胞工程、微生物细胞工程。微生物细胞工程属于微生物工程（发酵工程）范畴，因此不在本书介绍范围之类。
1.2.1 细胞工程发展历史
1.2.1.1 探索期
细胞工程的历史可以追溯到19世纪。1838年，马勒（Mahler）发现了脊椎动物肿瘤细胞中的多核现象。1885年，卢克斯（Roux）发现鸡的神经细胞在生理盐水中可以存活，并使用了“组织培养”（tissue culture）一词。1907年，美国生物学家哈里森（Harrison）从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，并尝试在青蛙凝固的淋巴液中进行培养，蝌蚪神经组织存活了几周，开创了动物组织培养的先河。
1902年，德国植物学家哈伯兰德（Haberlandt）提出了细胞全能性学说，并进行了植物单个细胞离体培养的尝试。1904年，汉里格（Hanig）在无机盐和蔗糖溶液中尝试进行萝卜和辣根菜的离体胚培养。1922年，考特（Kotte）和罗宾斯（Robbins）进行豌豆、玉米、棉花的根尖和茎尖培养并获得初步成功。1937年，荷兰植物学家温特（Went）发现B族维生素和生长素对植物根的生长具有促进作用。1937～1938年，法国科学家高特里特（Gautheret）和诺比考特（Nobercourt）几乎同时离体培养了胡萝卜组织，并使细胞成功增殖。
1.2.1.2 诞生期
1956～1959年，斯沃尔（Swarup）利用低温处理三棘刺鱼获得了三倍体，并饲养至性成熟。1959年，美籍华人科学家张明觉首次获得了体外受精动物——试管兔。1962年，凯普斯提克（Capstick）等成功地进行了仓鼠肾细胞的悬浮培养，为动物细胞大规模培养技术的建立奠定了基础。1958年，日本学者冈田善雄发现经过紫外线灭活的仙台病毒可以引起艾氏腹水瘤细胞的融合。1965年，哈里斯（Harris）和沃特金斯（Watkins）进一步证明灭活的病毒在适当条件下可以诱导动物细胞的融合。
1948年，斯库格（Skoog）等发现腺嘌呤可以诱导芽的形成，1956年，米勒（Miller）从鱼精子中分离得到比腺嘌呤活性高的激动素，并与斯库格一起提出了植物激素控制器官形成的观点，认为生长素与分裂素的比例是控制植物细胞分化的关键：生长素与分裂素比例高时利于根的生长，比例低时利于芽或茎的分化，比例相当时利于保持分裂但无分化的状态。这个规律的发现极大地推动了植物组织培养技术的发展。1958年，史都华德（Steward）和赖纳特（Reinert）发现胡萝卜的体细胞可以分化成体细胞胚，这成为植物组织培养领域的一个重大突破，也进一步验证了细胞全能性学说。1960年，兰花等植物无性繁殖获得成功，开辟了利用植物组织培养快速繁殖植物的有效途径。
1965年，德偌贝提斯（Derobetis）将其编著的《普通生物学》改为《细胞生物学》标志细胞生物学的诞生，为细胞工程的诞生提供了理论基础。体外受精、植物组织培养等技术的初步建立，推动了20世纪70年代前后细胞工程学科的形成。
1.2.1.3 快速发展期
20世纪70年代开始，随着细胞生物学、发育生物学、生物化学、分子生物学、遗传学等学科的发展和研究的日益深入，细胞工程进入快速发展阶段。
1973年，我国科学家童第周等在金鱼和鳑鲏鱼间成功进行核移植获得了种间杂种鱼。1975年，科勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）成功构建能分泌单克隆抗体又能体外大量增殖的杂交瘤细胞，从而建立了杂交瘤技术。1977年，英国采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿。1981年，埃文斯（Evans）和科夫曼（Kanfman）成功地分离到小鼠胚胎干细胞。1983年，帕尔米特（Palmiter）和布林斯特（Brinster）将大鼠生长素基因转入小鼠培育出生长快的超级小鼠。1984年，丹麦科学家维拉德森（Villadsen）成功利用胚胎细胞克隆出绵羊，首次通过核移植技术克隆成功哺乳动物。1987年，戈登（Gordon）获得分泌组织型纤溶酶原激活物（tPA）的转基因小鼠。1987年，美国国家科学基金会提出组织工程（tissue engineering）概念。1997年，英国利用成年动物体细胞克隆出绵羊“多莉”，证明了高等动物体细胞的全能性。之后，小鼠、牛、猪等均成功获得了体细胞克隆后代。1998年，美国科学家汤姆森（Thomson）成功分离建立了人的胚胎干细胞系，极大地促进了干细胞研究。2018年，中国科学家孙强团队成功克隆出两只食蟹猴，这是世界首例通过体细胞克隆技术诞生的灵长类动物。
20世纪70年代初，加拿大华裔科学家高国楠发现聚乙二醇可以促使植物原生质体融合，植物细胞融合技术初步建立。1981年，齐默曼（Zimmerman）利用可变电场诱导原生质体融合，建立了细胞融合的物理方法，进一步完善了细胞融合技术。1972年，美国科学家卡尔森（Carlson）等用NaNO3作为融合诱导剂进行烟草原生质体融合，获得了世界上第一个体细胞杂种植株。1973年，利希（Nitsh）采用花药培养获得了烟草植株。同年，古谷树里（Furuya）等通过培养人参细胞生产人参皂苷，开创了植物代谢产物生产的新途径。
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