第一章 绪论
　　第一节 概述
　　欢迎同学们到生物化学与分子生物学实验室来！生物化学与分子生物学主要是从微观即分子的角度来研究生物现象，涉及物理、化学、数学、生物学等多学科的交叉。其在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节，是目前自然科学中进展最迅速、最具活力的前沿领域。生物化学与分子生物学实验课不仅给学生提供一个验证理论知识、学习这一领域中有关实验技术的机会，也给学生提供了一个当科学家的机会。
　　实验课是实现理论联系实践，培养学生创新能力、应用能力的重要方式。通过具体的实验操作，使学生掌握生物化学与分子生物学的基本实验方法和技能，锻炼学生的动手能力。通过实验训练学生观察、比较、记录、分析、判断、推理和综合等科学思维能力、独立工作能力和事实求是的科学作风。实验可以训练观察、记录、分析、判断、推理等能力；训练科学地解释实验结果，清晰而富有逻辑地将结果表达出来的能力。从学术意义上说，实验课是学生正式走上科学研究或其他工作岗位前的一种培训，而不仅仅是照着实验指导完成一系列操作、最后交份报告的课程。
　　第二节 生物化学与分子生物学实验技术发展简史
　　生物科学在20世纪有惊人的发展。其中，生韧化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。
　　20年代：微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000×g(5000～8000 r．min-1)相对离心力的超离心机（相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”），开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。
　　30年代：电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。
　　40年代：层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。“电泳技术”是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。
　　50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg酋次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。
　　60年代：各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如高效液相色谱(HPIC)技术、红外、紫外、圆_色等光谱技术、核磁共振(NMR)技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计山氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-线结构分析，Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。
　　此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968年～1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。
　　70年代：基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并绳化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。
　　80至90年代：基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术(HPCE)，由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。
　　1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。
　　1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。除上述历史以外，还可以列出许多生物化学发展史上的重要成就，分述如下。
　　美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。
　　美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。
　　英籍德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了兰羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美籍德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。英国生物化学家Sanger逐于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。
　　1959年，美籍西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。
　　美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸mRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有mRNA的结构均相似。美籍印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的已知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。
　　法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。
　　1988年，美国遗传学家McClintock由于在20世纪50年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。
　　法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。
　　1988年，美国遗传学家McClintock由于在20世纪50年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。
　　1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。
　　1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诸贝尔生理医学奖。
　　1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。
　　1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40～70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。
　　我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪献、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。
　　1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1 983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。
　　由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是板为重要的。
　　第三节实验的基本要求
　　一、实验课要求
　　(1)学生必须按时参加实验课，不得迟到早退，迟到15分钟者，不得参加本次实验。
　　(2)实验前必须做好预习，明确实验内容、目的、方法和步骤。
　　(3)学生进入实验室必须衣着整洁，不得穿拖鞋及背心进入实验室。严禁高声喧哗、吸烟、随地吐痰和吃零食，不得随意动用与本实验无关设备。
　　(4)实验预习准备就绪后，经指导教师检查同意后，方可进行实验。学生在实验中应严格遵守仪器设备操作规程，认真观察和分析现象，如实记录实验数据，独自分析实验结果，单独完成实验报告，不得抄袭他人实验结果。
　　(5)实验中要爱护仪器，注意安全，节约水、电、元件等消耗材料，凡违章操作，不听教师指挥而造成事故，损坏仪器者，必须写山书面检查，并按有关规定赔偿损失。
　　(6)实验中若发生仪器故障或其他事故，应立即切断电源、水源等，停止操作，并报告指导教师，待查明原因或排除故障后，方可继续进行实验。
　　(7)实验完毕应及时关好电和水，并将仪器设备、工具等整理好放回原位，请指导教师检查同意签字后，方可离开实验室。
　　(8)应按时完成实验报告，凡实验报告不符合要求者，必须重做。
　　二、实验室安全须知
　　(1)实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验目的，掌握实验原理，操作关键步骤及注意事项，写好实验预习报告。
　　(2)实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静。
　　(3)实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验，注意观察实验过程中出现的现象和结果，并认真进行实验记录，对实验结果展开讨论，结果不良时，必须重做。实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。
　　(4)实验中，将移液枪、吸量管、药品等用完后放回原处，实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品(尤其是NaOH)洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。
　　(5)多余的重要试剂和各种有污染的液体和凝胶，要按教师要求进行回收，如昂贵的Sephadex、Sep

目录
第一章 绪论 1
第一节 概述 1
第二节 生物化学与分子生物学实验技术发展简史 1
第三节 实验的基本要求 3
第四节 实验记录和实验报告的撰写 8
第二章 实验基本操作技能 10
第一节 实验技能的内涵 10
第二节 常用玻璃仪器及器皿的使用、洗涤和干燥 11
第三节 常用仪器及设备的使用 13
第三章 生物化学基本理论 15
第一节 层析技术 15
第二节 离心技术 24
第三节 电泳技术 28
第四节 透析和浓缩 33
第五节 盐析技术 34
第四章 生物化学实验 35
实验一 蛋白质的盐析与透析 35
实验二 凝胶层析法分离蛋白质 37
实验三 酶作用的特异性和影响酶促反应速度的因素 38
实验四 琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的竞争性抑制作用 41
实验五 酮体的生成和氧化 43
实验六 精氨酸酶在尿素生成中的作用 44
实验七 维生素C的性质及含量测定 46
实验八 血钙的测定 47
实验九 血清胆固醇总量的测定 49
实验十 双缩脲法测定蛋白质 52
实验十一 酵母蔗糖酶‰值的测定 54
实验十二 饱食、饥饿和激素对小鼠肝糖原含量的影响 56
实验十三 转氨基作用与血清谷丙转氨酶活性的测定 57
实验十四 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 60
实验十五 碘—淀粉比色法测定血清淀粉酶 62
实验十六 血清乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离 64
实验十七 血清蛋白质的凝胶等电聚焦电泳 65
实验十八 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量测定 67
实验十九 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白质 69
实验二十 血清甘油三酯的测定 72
实验二十一 GPOPAP法测定血清（浆）甘油三酯 74
实验二十二 蛋白质含量的测定（凯氏定氮法）76
实验二十三 溴甲酚紫法测定血清白蛋白 78
实验二十四 胡萝h素的柱层析分离 79
第五章 分子生物学基本理论 81
第一节 分子生物学实验室需要的仪器配置 81
第二节 分子生物学实验基本操作技术 84
第三节 基因操作概述 88
第六章 分子生物学基本实验 93
实验一 肝组织核酸的分离与鉴定 93
实验二 核酸的定量分析 94
实验三 大肠埃希菌感受态细胞的制备 96
实验四 DNA的转化及阳性克隆的筛选 98
实验五 DNA的限制性酶切反应 99
实验六 多聚酶链式反应(PCR)技术 101
实验七 RTPCR扩增目的基因 103
实验八 实时PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸 106
第七章 综合性实验 109
第一节 综合性实验概述 109
第二节 综合性实验 109
实验一 血清Y球蛋白的分离提绝纯109
实验二 糖尿病诊断实验 111
实验三 基因组DNA的分离和含量测定 118
实验四 RNA的分离和含量测定 125
实验五 质粒DNA的提取与鉴定 132
第八章 设计性实验 140
第一节 设计性实验概述 140
第二节 设计性实验 141
实验一 唾液淀粉酶最适pH的测定 141
实验二 RTPCR 142
第九章 虚拟仿真实验 143
第一节 虚拟仿真实验概述 143
第二节 虚拟仿真实验 144
实验一 利用Map viewer查找人白介素IL18基因序列、mRNA序列和氨基酸序列 144
实验二 SLClIA1蛋白跨膜结构域的预测148
实验三 抗菌肽LL37的理化性质分析和二级结构预测 151
参考文献 155
附录 156