第一篇绪论
第一章常用仪器设备及基本实验技术
第一节显微镜的结构和使用方法
一、普通光学显微镜
（―）实验目的
1.了解普通光学显微镜的基本结构和工作原理。
2.掌握低倍镜和高倍镜的正确使用方法。
3.了解普通光学显微镜维护的注意事项。
（二）实验物品
普通光学显微镜，标本，擦镜纸，擦镜液，香柏油等。
（三）实验原理
普通光学显微镜包括正置和倒置光学显微镜，二者的结构类似，其不同在于物镜与照明系统是否颠倒，下面以正置光学显微镜为例说明。
显微镜包括机械和光学两个部分（图1-1-1）。
1.机械部分
（1）镜座：是显微镜的底座，常为一马蹄形铁座，用以支持和稳定显微镜。
（2）镜臂（执手）：是移动显微镜时的执手处，呈弓形，与镜柱相连处有一倾斜关节，可使显微镜向后倾斜至90°以内的任何角度，但一般不宜超过40°
，以免显微镜倾倒（注意：观察能流动的液体材料时则不宜倾斜）。
（3）镜柱：连接镜座和镜臂的直立短柱，对镜臂起支撑作用。
（4）大螺旋（粗调节器）：转动时，可使镜筒作较大距离升降，能调节物镜与标本间的距离，
得到清晰的物像（注意：转动螺旋时，不能太快太急，必须慢慢地旋转）。
（5）小螺旋（细调节器）：转动时，可使镜筒缓慢地上下升降，能更精细地调节物镜与标本间的距离，显示更清晰的物像。
（6）标本移动器：位于载物台侧面，通过旋转标本移动器可使标本进行左右、前后方向的移动。
（7）旋转盘：呈圆盘形，一般具有螺纹形圆孔2～4个，用于放置几个不同放大倍数的物镜，旋转盘可旋转，可随意调换各个不同倍数的物镜（注意：转换
物镜时必须用手转动旋转盘而不能用手拿着物镜来旋转，否则镜头易松脱，转动时亦不能过急过快）。
（8）载物台：为呈圆形或方形的平面台，中心有通光孔（供光线通过），载物台上装有标本移动器，既可固定玻片标本，又可前后左右移动。标本移动器
上有标尺，可利用标尺上的刻度作标记，记认要观察的标本。
2.光学部分
（1）光源：电光源显微镜以可见光为光源，只需通过调节旋钮，即可连续地增强或降低光线的强度（注意：电光源不能长期处于高亮状态！在不观察标本
的时候必须把光源调暗）。
（2）聚光镜：位于载物台通光孔的下方，由一片或数片透镜组成，可把反光镜反射来的光线聚合成光束，使较强的光线照于标本上，以便于观察。
（3）虹彩光圈：装在聚光镜下方，可调节光线的强弱。虹彩光圈由十几张金属薄片组成，外侧有一个细柄，推动它可调节光圈开孔的大小，从而调节光线
强弱。
（4）目镜：呈圆筒形，安装于镜筒的上端，由两个透镜组成，上面刻有此镜的放大率如5X、6X、10X等符号，即放大5倍、6倍、10倍等，一般实验中用10X
的目镜。
（5）物镜：呈圆筒形，装在旋转盘下，生物学显微镜一般有两种或三种物镜（图1-1-2）。
1）低倍镜：镜身较短，上刻有5X、10X的符号，即放大5倍、10倍的物镜。
2）高倍镜：镜身较长，上刻有40X、45X、65X的符号，即放大40倍、45倍、65倍的物镜。
3）油镜：镜身较长，上刻有100X的符号，即放大100倍的物镜。
显微镜的放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。例如，物镜为45X，目镜为10X时，总放大倍数为45X10=450。制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～
1.78，所用介质的折射率越接近玻璃越好。普通光线的波长为400～700nm，分辨力数值不会小于0.2pm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的*大设计倍数为
1000X。
图1-1-2显微镜物镜
注意：透镜不能用手去摸，以免损坏或弄脏镜头，只能用擦镜纸揩拭。
大多数显微镜，通常在物镜上都标有表示主要性能的参数，如10倍物镜标有10/0.25和160/0.17，此处10为物镜的放大倍数，0.25为数值孔径（有的写成
N.A.0.25），160为镜筒长度（单位：毫米），0.17为所要求的盖玻片厚度（单位：毫米）。以上各主要参数的推算，物理意义和显微镜的放大原理，将在物理
学的课程中学习。现对使用显微镜时要注意第一章常用仪器设备及基本实验技术的相互间有影响的几个主要性能简述如下：
A.分辨率（鉴别率、分辨力和分辨本领）：分辨率（resolvingpower，R）指能区分开两个物点间*小距离的能力，显微镜的分辨力主要由物镜的分辨力决
定，它是指可以分辨被检物体微细结构的能力，也就是分辨两个物点之间*短距离的能力。因此，分辨力和*小分辨距离是成反比的。R=2NA/A，其中k为入射
光线波长，NA为镜口率（数值孔径），计算公式为NA=n sina/2（n为介质折射率；a为镜口角，样品对物镜镜口的张角）。
B.放大率（放大倍数）显微镜适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，所以有效的放大率一般应为数值孔径的500～1000倍。在选择总放大倍数时，要考虑
物镜与目镜的匹配，并不是越大越好。超过了上述限度，物像反而会越来越模糊。
C.清晰度：是指影像上各细部影纹及其边界的清晰程度。它除了主要与物镜的性能有关外，亦与其他性能有关。如前述，物镜与目镜的组合超出了有效的放
大倍数时亦影响清晰度。
D.焦点深度（场深）在显微镜中形成一个清晰物像的物体层厚度称为焦点深度，也就是说，当焦点与某一物点一致时，这一点和其上下两侧都能看得清楚，
这清晰部位的厚度就是焦点深度。焦点深度与物镜的数值孔径或显微镜的总放大率成反比，所以在使用高倍镜时，必须不断、轻微地反复转动小螺旋，才能观察
到被检物不同深度的各层结构。
E.镜像亮度：镜像亮度与数值孔径的平方成正比，与显微镜的总放大率的平方成反比。在其他条件相同时，数值孔径越大，则镜像越亮。
镜像亮度和视野亮度不同，视野亮度不仅与物镜和目镜有关，而且还与聚光器、虹彩光圈、反光镜和光源有关。
（四）实验步骤
使用显微镜时，除注意视野亮度及焦距的调节外，还要注意显微镜各主要性能相互间的关系，才能发挥*好的观察效果。在使用显微镜时要按不同检视法要
求的步骤进行。
1.低倍镜的检视法
（1）将显微镜正放在离桌边3～6cm处；镜臂对向自己的左胸前，便于左眼观察，右眼画图。调节倾斜关节，使载物台保持适宜的角度，注意倾斜角度不能
过大，否则显微镜易失去重心而倾覆。
（2）将大螺旋逆时针方向转动，降低载物台，然后转动旋转盘，使目镜与低倍物镜对准。
（3）将光源打开，从目镜中观察，并旋转旋钮调节光源使光度合适。
（4）将玻片标本置于载物台上，把标本所观察部分移至通光孔中央处。
（5）观察者一面从旁边观察，一面按顺时针方向转动大螺旋，使载物台徐徐上升，直至物镜与玻片将要接触为止（切勿使物镜与玻片相碰）。
（6）从目镜向下看，同时将大螺旋徐徐按逆时针方向转动，使载物台下降至标本的物像出现为止。
（7）旋动小螺旋，使载物台稍向上或稍向下移动，至物像清晰为止。
（8）可一面观察，一面移动玻片，寻找所需要的部分，并把它置于视野中央。
2.高倍镜的检视法高倍镜的放大率较大，适合观察物体的细微结构，但必须在低倍镜下找到物像后，才能转换为高倍镜，具体步骤：
（1）如上法，先用低倍镜找到标本，并把己调清晰的物像移到视野中央。
（2）直接转动旋转盘换上高倍镜。
（3）—边观察，一边调节小螺旋（注意此时不能用大螺旋调节）直到物像清晰为止，若视野亮度不够时，可把光线亮度增大（普通光源显微镜可调节光源
，或放大虹彩光圈），使视野的亮度合适。
（4）观察完毕后，必须先转回低倍物镜，再取下标本，以免高倍物镜头被碰坏或沾污。
3.油镜检视法在低倍镜下把要观察的部位移到视野中央，转动旋转盘换上高倍镜，把观察的物像调清晰后移到视野中央，转动旋转盘移开高倍镜，在玻片的
观察部位滴一滴香柏油，注意此时不能移动大螺旋，再换上油镜，使油镜镜头与香柏油油滴接触，调节小螺旋直到物像清晰。
油镜使用完毕，必须把镜头和玻片标本上的香柏油擦净。
油镜的正确擦拭方法：
（1）镜头的擦拭：先用擦镜纸把镜头的油抹去，再用擦镜纸蘸少许擦镜液把镜头上的香柏油去掉，然后用干净擦镜纸擦拭干净。擦拭时用力要轻，要顺着
镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周涂擦。
（2）玻片标本的擦拭：先用一张擦镜纸把标本玻片上的香柏油擦去，再滴一滴擦镜液在擦镜纸上，轻轻放在载玻片上向外拉，如此反复几次便可擦净（注
意：镜头和载玻片的擦拭均不能来回涂抹，且擦镜液不能加得太多）。
（五）实验报告
1.比较低倍镜和高倍镜下观察物像有什么区别？
2.简述使用油镜的注意事项。
（六）注意事项
1.取镜时，必须右手握镜臂，左手托镜座，使镜身保持平稳和直立，以免目镜、反光镜等滑出。
2.实验前后，应详细检查显微镜的零件，如有损坏或丢失，应立即报告老师，切勿自行修理。严禁自行拆卸任何零件。
3.实验前，应将显微镜擦干净，光学及照明部分的镜面只能用擦镜纸擦净，不能用手指、毛巾、纸等来涂擦，以免损坏。其他部分可用纱布擦净。
4.使用显微镜的过程中切忌急躁，观察时必须先在低倍镜下找到物像后才能转用高倍镜观察，高倍镜找到物像后才能转油镜观察。
5.显微镜不能在日光直射下使用。
6.显微镜使用完毕，转动大螺旋上升镜筒或下降载物台，取下标本，转动旋转盘使物镜离开通光孔，再下降镜筒或上升载物台使之接近物镜。
7.画图时，要学会双眼睁开，用左眼观察，右眼画图，以减少眼睛的疲劳。
（叶文红）
二、荧光显微镜
（―）实验目的
1.了解荧光显微镜的工作原理。
2.了解荧光显微镜的操作步骤与注意事项。
（二）实验原理
荧光显微镜（fluorescence microscope）利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统
发出一定波长的光作为激发光，在激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即
使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于研究细胞结构、细胞内物质的吸收、运输及化学分布和定位（图1-1-3）。
图1-1-3荧光显微镜
（三）实验步骤
1.用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的灯光，除去显微镜的防尘罩，确保显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜
臂连接。
2.将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。
3.打开电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的±5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一
次启动未点燃汞灯，可以多揿动几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到*大发光效率，即可开始工作。
4.显微镜的调试
（1）任选一块标本放在载物台上。
（2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光（V）或蓝光（B）或绿光（G）激发滤色片组转入光路，并将10X荧光物
镜转入光路。
（3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。
（4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光阑成像清晰，转动视场光阑拨杆将视场光阑收小，调节视场光阑调中螺钉使视场光阑居中，然
后再将视场光阑开至*大。
（
展开
