**章临床分子生物学检验标志物
　　绪论
　　以沃森（ Watson）和克里克（ Crick）提出的DNA双螺旋结构理论为先导，开创了现代分子生物学的先河。分子生物学是以蛋白质、核酸等作为主要研究对象的一门学科，随着分子生物学理论的不断丰富以及分子生物学技术的不断发展，分子生物学的研究对象逐步囊括了基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学。在临床应用中，以上述多组学标志物为靶标的分子生物学检验对疾病预防、诊断、预估预后、制定个体化医疗方案等起着重要作用。
　　**节分子生物标志物的概念和分类
　　生物标志物在临床实践中具有重要的应用价值。分子生物标志物是生物标志物的一种类型，包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质和代谢产物等多种类型。
　　一、生物标志物的概念
　　疾病标志物（markers of disease）已经被使用了几个世纪，但直到20世纪80年代，生物标志物（biomarker）这个术语才被广泛使用。生物标志物被定义为“作为正常生物过程、致病过程或治疗干预的药理学反应的指标，被客观测量和评估的特征”。这个定义不仅包括分子生物标志物，也包括成像生物标志物（如磁共振成像、正电子发射体层成像、 X射线）和其他指标（如体温、血压）。
　　生物标志物不仅可以从分子水平探讨发病机制，而且在准确、灵敏地评价早期、低水平的损害方面有着*特的优势，可提供早期预警指标，在很大程度上为临床医生提供辅助诊断的依据。此外，生物标志物还可用于疾病诊断、疾病分期或评价新药以及新疗法在目标人群中的安全性和有效性。因此，生物标志物具有非常广泛的应用。
　　二、分子生物标志物的概念
　　分子生物标志物是生物标志物的一种类型，是指可以被用于临床疾病诊断、疗效观察以及患者预后监测的生物分子。临床研究中，所涉及的生物分子有很多，但只有可以利用简便有效的检测技术手段对其进行定性或定量检测分析的生物分子，才是临床适用的分子生物标志物。
　　三、分子生物标志物的分类
　　分子生物标志物按照自身性质，分为核酸分子生物标志物（ DNA生物标志物和RNA生物标志物）、蛋白质生物标志物和代谢产物生物标志物等。
　　（一）DNA生物标志物
　　DNA是重要的分子生物标志物， DNA序列的改变（突变或多态性）或者本身含量的变化与疾病有着密切的关系。基因突变是各种单基因遗传病产生的原因，也是*直接的疾病诊断的分子生物标志物。
　　在肿瘤的分子诊断中，癌基因（如Myc家族、ras家族等）、抑癌基因（如Rb基因、p53基因等）和错配修复基因的突变都可以作为DNA生物标志物。
　　（二）RNA生物标志物
　　RNA作为转录产物，也是一种重要的核酸分子生物标志物。 RNA生物标志物包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circRNA）、核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和外泌体RNA（exosome RNA，exRNA）等。
　　（三）蛋白质生物标志物
　　目前，临床使用的大部分蛋白质生物标志物主要使用免疫学方法进行检测，血清等体液样本是*重要的样本类型。蛋白质生物标志物检测有多种技术方法，如放射免疫分析、化学发光酶联免疫分析法、荧光免疫分析、电化学发光免疫分析和质谱法等。
　　（四）代谢产物生物标志物
　　随着高通量技术的发展，代谢组学、糖组学和脂质组学等在疾病研究中的运用，代谢产物成为新的分子生物标志物。代谢产物生物标志物大多是低分子量的化合物，包括糖、氨基酸、有机酸、核苷酸和脂类等。
　　代谢组学能够对生物体内特定生理时期内所有低分子量的代谢物同时进行定性和定量分析，再结合模式识别方法，判断出生物体的病理生理状态，寻找代谢物与病理生理变化的相对关系，从而找到与之相关的生物标志物。主要技术手段包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳与质谱联用技术等。
　　第二节核酸分子标志物
　　由于DNA/RNA测序和芯片技术的发展，疾病的分子标志物被不断发现，已经成为较为有前途的标志物类型。
　　一、基因组和基因组特征
　　一个物种的单倍体染色体数目，及其所包含的全部遗传物质，称为该物种的基因组。例如，人类基因组包括核基因组（ 22条常染色体以及X或Y染色体上的全部遗传物质）和线粒体基因组。自然界中从简单的病毒到复杂的高等动植物，均拥有自己*特的基因组序列。
　　（一）病毒基因组
　　病毒（ virus）是自然界中普遍存在的一种结构简单、无法*立繁殖，只能在宿主细胞内进行复制的微生物。除朊病毒外完整的病毒颗粒是由核酸和蛋白质构成的。核酸是病毒的核心，构成了病毒的基因组，以保证病毒的增殖、遗传和变异等功能。病毒基因组结构简单，核酸类型多样，具有重叠基因现象，无重复序列，非编码序列少，某些病毒基因具有内含子结构。
　　（二）原核基因组
　　原核生物基因组通常只包含一条环状双链DNA（double stranded DNA，dsDNA），也称为染色质。大多数原核生物只包含一条染色质，以类核的结构存在于细胞中。原核生物的基因组相对较小，往往以操纵子的形式存在，不具有内含子。
　　（三）真核基因组
　　真核生物基因组由一条或多条线性DNA染色体组成。组成真核生物基因组的染色体数量差异很大，例如，杰克跳线蚂蚁和无性线虫的基因组只有一对染色体，而蕨类物种有720对染色体，人类细胞具有22对常染色体和1对性染色体。
　　除了细胞核中的染色体外，真核生物的细胞器，如叶绿体和线粒体均拥有自己的DNA和染色体，因此也有“线粒体基因组”和“质体基因组”的说法。线粒体和叶绿体都含有环状DNA。与原核生物不同，真核生物具有蛋白质编码基因的外显子-内含子组合，和一定数量的重复DNA。大多数哺乳动物和植物基因由重复DNA组成。真核生物基因组特征如下：
　　1.编码序列携带合成蛋白质遗传信息的DNA序列是编码序列，不同物种中编码序列占基因组的比例差异很大。较大的基因组不一定含有更多的基因，并且复杂真核生物中非重复DNA的比例随着基因组大小的增加而减少。简单的真核生物如秀丽隐杆线虫和果蝇中编码DNA的比例高于重复DNA。而更复杂的真核生物基因组则往往主要由重复DNA组成。一些植物和两栖动物基因组中重复DNA的比例超过了80%。同样，人类基因组中只有2%编码DNA。
　　2.非编码序列非编码序列包括了内含子、非编码RNA序列、调控DNA和重复DNA。人类基因组的98%属于非编码序列。基因组的重复DNA有串联重复序列和分散重复序列。
　　3.转座因子转座因子（ transposable element，TE）一般指跳跃基因，是一段可以从原位上单*复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。 Ⅰ类TE通过复制和粘贴机制跳动位置，Ⅱ类TE从基因组中切除并插入新位置。
　　TE的“运动”是真核生物基因组进化的驱动力，因为它们的插入可以破坏基因功能， TE之间的同源重组可以导致基因的复制，TE还可以将外显子和调节序列改组到新的位置。
　　4.逆转录转座子逆转录转座子可以转录成RNA，然后在另一个位点被复制到基因组中。逆转录转座子可分为长末端重复序列（ long terminal repeat，LTR）和非长末端重复序列（非LTR）两大类。
　　二、基于基因突变的核酸分子标志物
　　基于基因突变的核酸分子标志物包括了点突变（错义突变、无义突变和RNA加工突变）、插入缺失突变（包括移码突变）和动态突变等。
　　点突变（ point mutation）也称为碱基置换，是指单个碱基的改变，在引起人类遗传性疾病的点突变中包括了错义突变、无义突变、RNA加工突变以及发生在调控区的突变等（图1-1）。
　　插入缺失突变（ insertion-delete mutation，indel mutation）分为小片段和大片段插入/缺失。小片段突变指的是在1～60个碱基范围内的改变，而大片段的插入/缺失甚至可以在染色体水平上检测到（图1-2）。
　　图1-1点突变示例图1-2插入缺失突变示例
　　动态突变（ dynamic mutation）是指三核苷酸的重复次数可随着世代交替的传递而呈现逐代递增累加突变效应的突变形式（图1-3）。
　　图1-3动态突变示例
　　三、基于基因多态性的核酸分子标志物
　　基因多态性（ gene polymorphism）为在同种生物不同个体的基因组中，同一位置的DNA序列具有不同的碱基排列顺序，且在人群中具有一定的分布频率（＞1%）。基于基因多态性的核酸分子标志物包括了限制性片段长度多态性、小卫星和微卫星多态性、单核苷酸多态性和拷贝数多态性。
　　限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphism，RFLP）是**代DNA分子标志物，为限制性内切酶可识别特异的DNA序列，在识别位点切开DNA分子，产生特定长度的片段。对于不同的个体而言，其DNA序列存在差别，如果这种碱基替换恰好发生在限制性内切酶的切割位点，就会造成酶切位点的减少或增加，或导致酶切片段长度的变化。
　　小卫星（ minisatellite）DNA和微卫星（ microsatellite）DNA多态性属于第二代DNA分子标志物。人类基因组10%～15%是串联重复（ tandem repeat）序列，以各自的核心序列（重复单元）*尾相连多次重复，长度可达105～106bp，又称为卫星DNA（satellite DNA），主要存在于染色体的着丝粒区域，通常不被转录。小卫星DNA是由10～100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次而形成的1～5kb的短DNA，又称为可变数目串联重复序列（ variable number of tandem repeat，VNTR）。微卫星DNA核心序列为1～6bp，可重复上百次，又称为短串联重复（ short tandem repeat，STR）序列，有单纯STR、复合STR和间隔STR等。
　　单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）为第三代DNA分子标志物，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中*简单、*常发生的一种。根据SNP在基因组中的位置， SNP分为编码区SNP、基因周边区SNP和基因间SNP。SNP通常并不直接致病，而是影响疾病的易感性。
　　拷贝数多态性（ copy number polymorphism，CNP）是指基因组中较大的DNA片段发生了拷贝数的变化，可以涉及一个基因，也可以是连续的几个基因，相当于染色体的某个区域发生了复制或缺失的改变。这种变异大约占人类基因组的12%，可以遗传也可由新发突变造成，与疾病的易感性有着密切关系。
　　四、基于DNA甲基化修饰的核酸分子标志物
　　DNA甲基化（ DNA methylation）是指生物体在DNA甲基转移酶（ DNA methyltransferase， DNMT）的催化下，以S-腺苷基甲硫氨酸（ S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。
　　DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5等位（图1-4）。在哺乳动物中（包括人类基因组），大约有1%的DNA碱基发生了甲基化。