**章 神经细胞培养常用技术
**节 神经元的分离和培养
一、基本原理及实验目的
通过将神经元和胶质细胞进行共培养，可实现低密度原代神经元的体外培养。体外培养的神经元，可用于病毒的瞬时转染、神经元形态（轴突、树突）及突触的结构观察、蛋白质在细胞内的分布观察及电生理学检测。
二、主要仪器设备、试剂及耗材
1. 仪器设备 洁净操作台、水平摇床、烤箱、解剖工具（眼科剪、尖头镊子）、37℃恒温水浴锅、体视显微镜、倒置相差显微镜、CO2恒温培养箱、细胞计数器等。
2. 试剂 硝酸（70%w/w）、100%乙醇、石蜡、L-多聚赖氨酸、硼酸、HBSS、2.5%胰蛋白酶、0.25%胰蛋白酶-EDTA、脱氧核糖核酸酶（简称DNA酶）、基础培养基（MEM）、葡萄糖、马血清、胎牛血清、青霉素-链霉素混合抗生素、神经元培养基（neurobasal-A）、GlutaMAX-Ⅰ和B27添加剂、75%乙醇、阿糖胞苷（cytosine arabinoside）、Lipofectamine 2000转染试剂等。
3. 耗材 圆形玻片（直径18mm）、玻片架、试管、培养皿、针头式过滤器、5ml移液管、10ml移液管、1ml移液器、70μm 细胞过滤器、洁净玻璃巴斯德吸管等。
三、操 作 步 骤
（一）细胞爬片和神经元培养皿的制备
1. 至少在培养日前1周， 将玻片放在玻片架上（图1-1-1），在硝酸（70%w/w）中浸泡1夜（根据实验安排可延长至几天）。
2. 将装有玻片的玻片架小心放置于盛有蒸馏水的培养皿中，置于水平摇床上低速洗涤硝酸浸泡过的玻片2次，每次1小时（摇床速度以不晃动玻片架为宜）。
3. 用100%乙醇冲洗玻片10分钟，具体操作方法同步骤2。
4. 将玻片从玻片架转移到玻璃烧杯，并用铝箔覆盖烧杯，置于225℃的烤箱中烘烤14小时，对玻片进行灭菌（在不揭开锡箔封口的情况下，玻片可以在烧杯中保存数周）。
5. 在洁净操作台内，用灭菌过的镊子取出玻片放置在培养皿中，然后在玻片上滴入3～4滴液体石蜡，作为玻片的支点。具体操作方法：将石蜡颗粒置于烧瓶中，随后置于持续沸腾的水中熔化石蜡。用洁净玻璃巴斯德吸管吸取玻璃瓶中煮沸的石蜡，快速在玻片的边缘点触4个石蜡点（图1-1-2）。60mm直径的培养皿可以容纳4个玻片，100mm直径的培养皿可以容纳10个玻片。
图1-1-1 承载玻片的玻片架
6. 配制0.1mol/L的硼酸溶液，溶解L-多聚赖氨酸（1mg/ml），并用0.2μm孔径的针头过滤器进行过滤。在洁净操作台内将玻片有石蜡支点的一面浸泡在L-多聚赖氨酸（1mg/ml）中，6小时后用灭菌的蒸馏水浸洗2次，每次1小时。
7. 将添加0.6%（W/V）葡萄糖和10%（V/V）马血清的MEM 缓慢添加到培养皿中，然后将培养皿放入CO2恒温培养箱，以备培养神经元。
（二）胶质细胞培养（培养前2周）
1. 出生后1天的小鼠，解剖分离大脑皮质，剥除脑膜。
2. 在洁净操作台上，用眼科剪在一个培养皿中将皮质组织剪碎。
3. 将切碎的组织转移到12ml的HBSS中，并加入1.5ml的2.5%胰蛋白酶和1%（W/V）的DNA酶。在37℃恒温水浴锅中孵育15分钟，每5分钟晃动1次。消化良好的组织会变得相互粘连，形成团块。用10ml移液管吹打10～15次，机械性分离组织和细胞，便于更好地消化。
4. 用5ml移液管将消化良好的组织吹打10～15次，直到大部分组织团块消失，培养基变浑浊。通过细胞过滤器去除未消化彻底的组织团块，以15ml基础培养基（MEM）重悬细胞，并添加葡萄糖0.6%（W/V）、10%马血清和青霉素-链霉素混合抗生素（1×）终止消化。
5. 离心细胞，120g离心5分钟，弃去上清液，然后用新鲜MEM重悬细胞，进行细胞计数，按照105个/cm2的密度接种于细胞培养皿中。
6. 第2天更换新鲜的MEM，去除未贴壁的细胞。
7. 每3～4天向培养皿中注入新鲜的MEM。在更换培养基之前，用手轻轻拍打培养皿底部5～10次，去除贴壁不牢的细胞。
8. 培养10天后，胶质细胞铺满培养皿底部的80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，分离获取胶质细胞悬液，细胞计数后取105个细胞接种于新的60mm 培养皿中。剩下的细胞进行冻存。
9. 神经元培养前3天，将胶质细胞培养基更换为神经元培养基（Neurobasal-A培养基，加入GlutaMAX-Ⅰ和B27添加剂）。
（三）神经元培养（以海马神经元培养为例，所有步骤均在室温下进行）
1. 取6～8只新生小鼠，75%乙醇喷洒进行皮肤消毒。在盛有HBSS 培养基的培养皿中分离海马（图1-1-3），用眼科剪将海马剪成小块后转移到15ml的试管中。
2. 用5mlHBSS 冲洗海马组织块2次，在试管内加4.5mlHBSS、0.5ml2.5%胰蛋白酶，将试管置于37℃恒温水浴锅中孵育15分钟，每5分钟翻转试管1次。消化良好的海马会变得黏稠并形成团（根据组织消化状态可延长消化时间5分钟）。
3. 加入适量HBSS 清洗海马3次，间隔静置5分钟。
4. 第3次洗涤后留2mlHBSS，用巴斯德吸管温和吹打海马组织块10～15次，注意尽量匀速、轻柔操作，避免有气泡产生。
5. 用酒精灯火焰将巴斯德吸管开口轻微熔化至直径缩小约1/2，再次吹打组织10次，切忌过度吹打，否则会造成细胞损伤，影响细胞存活率。
图1-1-2 点石蜡的玻片
图1-1-3 分离的海马
6. 将离心管静置5分钟，直到未完全吹散的组织沉到底部（分散的细胞应悬浮在HBSS 中）。使用1ml移液器轻轻将悬浮在HBSS 中的神经元转移到包含培养液和细胞爬片的培养皿中（105个/60mm 培养皿），轻轻摇动培养皿使细胞均匀分布，置于37℃的CO2恒温培养箱中培养。
7. 对剩下的团块重复上述步骤5～6次，直到大部分组织被吹散。
8. 细胞接种2～4小时后，用倒置相差显微镜观察细胞贴壁情况。大多数神经元贴壁，贴壁的细胞圆而明亮（图1-1-4）。用尖头镊子将玻片翻转，置于有神经元培养基预处理的胶质细胞培养皿上，石蜡点面朝下。
9. 神经元可与胶质细胞共培养长达1个月，其间每7天补充1ml新鲜神经元培养基。
10. 接种后1周，加入阿糖胞苷至终浓度为5μmol/L，抑制胶质增生。此步骤可选择性使用。
图1-1-4 倒置相差显微镜下神经元铺板后不同时间的形态
A. 刚铺板时的神经元；B. 铺板2小时后的神经元，已贴壁并生出突起
（四）脂质体介导的原代培养海马神经元转染
1. 体外培养第3天，将盖玻片翻转到预先准备好的胶质细胞培养皿中，使石蜡点面朝上。
2. 将总量1μg（0.25μg/ 玻片）的DNA混合在1.7ml试管中，转染4个玻片。加入100μl Opti-MEM 培养基混合后置于试管架上。
3. 取新的1.7ml试管，将3μl 的Lipofectamine 2000转染试剂（DNA量的3倍）与100μl Opti-MEM 培养基混合，室温静置5分钟。
4. 将步骤2中的100μl DNA溶液与步骤3中100μl 的转染试剂混合，室温静置5～10分钟。
5. 取50μl 步骤4中的转染混合液加在每个玻片上，注意将枪头插入培养基液面下但不接触玻片，缓慢将液体推出，避免DNA混合物扩散。缓慢移动，将培养皿放回CO2恒温培养箱。
6. 30～45分钟后再次将玻片翻转回初始胶质细胞培养皿中，石蜡点面朝下，继续培养。
四、注意事项
1. 脑组织分离后的所有步骤都应在洁净条件下进行，并严格遵守无菌操作原则；培养过程中每日观察神经元的时间应尽量缩短，以减少培养皿在CO2恒温培养箱外的停留时间。
2. 接种早期神经元大量死亡的原因可能有：过度吹打细胞；胶质细胞培养基没有充分共培养。
3. 培养3天后神经元开始死亡，培养7天则仅有少量细胞存活的可能原因：玻片质量不过关；玻片处理不彻底。后者可考虑更换新的70%硝酸，或在70%硝酸处理后再用100%乙醇配制的饱和KOH 浸泡，以彻底去除玻片上残留的有害物质。
4. 神经元培养体系中包含较多胶质细胞的可能原因：海马组织分离不干净；鼠龄较大，建议选择新生小鼠。
（杨睿）
第二节 星形胶质细胞的分离和培养
一、基本原理及实验目的
星形胶质细胞数量多，在脑内分布范围广，与中枢神经系统内环境稳定及多种疾病的病理生理过程密切相关。原代培养新生鼠（出生后1～3天）的大脑皮质或海马，获取混合细胞；根据星形胶质细胞的生长特性，可对其进行分离纯化，为体外试验提供可行方法。
二、主要仪器设备、试剂及耗材
1. 仪器设备 超净操作台、倒置相差显微镜、体视显微镜、荧光显微镜、细胞培养箱、低速离心机、37℃恒温水浴锅、小烧杯（2个）、眼科镊（直头1个、弯头2个）、眼科剪、小玻璃瓶、玻璃巴斯德吸管（弯头）、培养皿（2～4个）、滤网（400目）、25cm2培养瓶、24孔培养板、15ml离心管、冰盒等。
2. 试剂 L-多聚赖氨酸，75%乙醇、D-Hanks 平衡盐溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM培养基（含1%青霉素/ 链霉素和10%FBS）、细胞冻存液、0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）、0.3%Triton、1%BSA、偶联CY3的二抗、DAPI 星形胶质细胞标记抗体——GFAP 抗体等。
3. 耗材 移液器、各种规格吸头、离心管、细胞计数板、马克笔等。
三、操作步骤（以昆明新生鼠为例）
（一）原代细胞混合培养
1. 培养前准备 原代培养前，进行相关试剂配制及培养瓶处理。
细胞培养所用器械均需灭菌；培养瓶和培养板使用L-多聚赖氨酸包被，37℃时间不少于30分钟，或4℃过夜，包被后的培养瓶和培养板晾干备用或用D-Hanks 平衡盐溶液冲洗2遍后直接使用。
D-Hanks 平衡盐溶液的配制：NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4 2H2O 0.12g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g、酚红0.02g，调pH 为7.2，加去离子水定容至1000ml，高压灭菌，4℃保存。L-多聚赖氨酸储存液：1mg L-多聚赖氨酸粉末溶于2ml灭菌蒸馏水中，浓度为0.5mg/ml。使用时做50倍稀释，终末浓度为10mg/L，4℃保存，储存液在-20℃保存备用。
细胞培养当日，细胞室和超净操作台均提前以紫外线灭菌30分钟。超净操工作台内准备器械，需3个培养皿，1个空培养皿用于取脑，1个加D-Hanks 平衡盐溶液的培养皿用于放取出的脑并剥离脑膜，1个加D-Hanks 平衡盐溶液的培养皿用于盛装去除脑膜后的大脑皮质和海马。超净操作台外，备75%乙醇，供小鼠皮肤消毒用。
2. 分离取脑 取出生后1～3天的新生鼠，乙醇消毒皮肤后放入超净操作台内的培养皿中，右手持眼科镊（弯头），左手压住小鼠后颈处以固定小鼠，右手用眼科镊快速夹开新生鼠头部皮肤，暴露颅骨。右手持眼科镊从枕骨大孔插入并向头端（吻侧）沿矢状缝划开，去掉左右顶骨，迅速取出完整的新生鼠脑，放入装有预冷D-Hanks 平衡盐溶液的培养皿中。
3. 剥离脑膜 去除小脑部分，留取双侧大脑皮质和海马。在体视显微镜下仔细剥离脑膜，然后放入另一装有预冷D-Hanks 平衡盐溶液的培养皿中，培养皿置于冰盒上。
4.
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