生命科学已经进入教材爆炸式增长时期。在坚持全员全过程全方位育人的背景下，《细胞生物学实验技术教程（第五版）》在第四版的基础上，补充更新了实验，整合成7章共66个实验。**章为基础细胞生物学实验，第二章到第六章涵盖了高级细胞生物学实验、植物转基因技术及检测、线虫的实验操作、果蝇的实验操作及动物细胞的实验操作，第七章立足于对学生综合创新能力的培养，收录了*都师范大学参加全国大学生生命科学竞赛获得一等奖的实验论文。《细胞生物学实验技术教程（第五版）》的撰写力求贯彻习近平总书记的要求“广大青年科技人才要树立科学精神、培养创新思维、挖掘创新潜能、提高创新能力，在继承前人的基础上不断超越。”培养学生沿着求知问学，沿着求真理、悟道理、明事理的方向前进，并引导学生培养综合能力，培养创新思维。《细胞生物学实验技术教程（第五版）》前六章均有实验目的、实验原理、结果分析及思考题等，并以二维码形式增加了彩图、拓展阅读、视频等数字资源。文前附加了教学课件申请单。

**章　基础细胞生物学实验
　　实验1.1　细胞膜的渗透性
　　【实验目的】
　　1.观察红细胞的溶血现象。
　　2.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
　　【实验原理】
　　在等渗环境中水分子通过细胞质膜进出细胞的速率相等，细胞的体积不会发生变化。当等渗溶液中的溶质分子通过简单扩散进入细胞，则会增加细胞内含物的浓度并降低细胞内的水势，水分子进入细胞内的速率大于流出速率，红细胞的体积膨胀增大；当红细胞体积增加30%时呈球形，体积增加45%～60%时由于细胞膜损伤而发生溶血，此时血红蛋白逸出至等渗溶液内，溶液由红细胞的悬浊液变为非细胞结构的澄清液，这也是判别细胞是否发生溶血的一个直接现象依据。由于红细胞对各种溶质的通透性不同，导致不同溶质进入红细胞的速率不同，溶血时间也不相同。因此，发生溶血现象所需时间的长短可作为测量物质进入红细胞速率的参考指标，从而可以测定细胞膜对不同物质通透性的差别。
　　【材料、试剂和器具】
　　1.材料 鸡血，兔血。
　　2.试剂 0.17mol/L NaCl，0.17mol/L NH4Cl，0.17mol/L CH3COONH4，0.17mol/L NaNO3，0.12mol/L（NH4）2C2O4，0.12mol/L Na2SO4，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮，抗凝剂，0.9% NaCl，0.75% NaCl等。
　　3.器具 普通光学显微镜，试管架，移液管架，注射器，50mL小烧杯，5mL移液管，试管，吸耳球等。
　　【实验步骤】
　　1.血液处理
　　（1）兔血。采用心脏采血法，将20mL血液置于含50mL抗凝剂的试剂瓶中，加入200mL 0.9% NaCl溶液并混匀，置于4℃冰箱暂存。使用时取10mL血液至100mL 0.9% NaCl溶液中，血细胞呈雾状悬液为佳。
　　（2）鸡血。采用抹颈采血法，将20mL血液置于含50mL抗凝剂的试剂瓶中，加入200mL 0.75% NaCl溶液并混匀，置于4℃冰箱暂存使用。使用时取10mL血液至100mL 0.75% NaCl溶液中，血细胞呈雾状悬液为佳。
　　2.溶血现象观察
　　（1）取一支试管，加入5mL蒸馏水，再加入0.5mL稀释的鸡血，迅速混匀，作为溶血实验对照。
　　（2）另取一支试管，加入5mL葡萄糖溶液，再加入0.5mL稀释的鸡血，迅速混匀，作为不溶血实验对照。
　　（3）仔细观察比较溶血实验对照和不溶血实验对照的血细胞溶液差异，有雾状现象出现说明血细胞没有发生溶血，雾状现象消失说明血细胞已经发生溶血。
　　（4）使用兔血代替鸡血，分别使用蒸馏水和葡萄糖溶液作为对照，重复上述步骤（1）～（3），仔细观察并比较兔血溶血实验和不溶血实验的血细胞溶液差异。
　　3.鸡红细胞膜对不同溶质通透性的观察 另取9支试管，分别加入5mL等渗溶液，再加入0.5mL稀释的鸡血，迅速混匀，注意观察颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记录溶血时间（自加入稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。将观察到的现象和结果写入表1.1.1，对实验结果进行比较和分析。
　　表1.1.1　不同溶液中的溶血现象观察
　　4.兔红细胞膜对不同溶质通透性的观察 使用兔血代替鸡血，重复上述步骤1～3，观察并记录自加入稀释兔血至溶血所需时间。
　　【实验结果】
　　不发生溶血的试剂溶液静置后有血细胞沉淀产生，发生溶血的试剂溶液静置后没有沉淀产生（图1.1.1，数字资源1.1.1）。
　　图1.1.1　鸡血溶血实验静置后沉淀结果
　　【思考题】
　　1.影响细胞膜通透性的因素有哪些？
　　2.比较不同溶液溶血时间的差异并分析原因，总结归纳其规律。
　　3.分析比较兔血和鸡血的溶血时间差异，分析其原因。
　　4.比较不同实验组间溶血时间差异和溶血先后顺序的一致性，分析其原因。
　　【附录】
　　（1）抗凝剂：称取NaCl 4.25g、柠檬酸钠30g，加蒸馏水定容至1L。
　　（2）纯水机的操作与使用视频参见数字资源1.1.2。
　　实验1.2　细胞的凝集反应
　　【实验目的】
　　1.了解植物凝集素的生化特征。
　　2.掌握细胞凝集的原理。
　　【实验原理】
　　在细胞膜表面，糖分子与脂或蛋白质相连形成细胞表面的糖脂或糖蛋白。目前认为细胞间的联系、细胞的生长及肿瘤发生均与细胞表面的分枝状低聚糖分子有关。
　　凝集素（agglutinin）是生命体内广泛分布的一种天然的非免疫性蛋白或糖蛋白，可与细胞膜表面的特异糖蛋白结合，具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用，是一个超级蛋白质家族，存在于众多植物的种子和营养组织中。动物细胞和植物细胞都能够合成并分泌凝集素。凝集素具有一个或以上与糖结合的位点，能够参与细胞的识别和黏着，将不同的细胞联系起来，因此在细胞识别和黏着反应中起重要作用。植物凝集素通常以其被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A（concanavalin A，Con A）、麦胚素（wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们的总称。
　　大豆凝集素是*早被描述的植物凝集素之一，能特异性结合N-乙酰基-D-半乳糖胺或半乳糖，与细胞膜上的受体分子形成交联，引起红细胞凝集反应。大豆凝集素具有凝集活性和促分裂活性，可对动物肠壁、刷状缘酶活性、小肠黏膜细胞代谢、肠道细菌生态物质代谢及免疫机能产生一定的影响，在糖生物化学、血型鉴定、生物医药等领域有着广泛的应用。大豆凝集素在大豆中含量较少，占大豆储藏蛋白含量的5%～7%。
　　马铃薯凝集素可与N-乙酰氨基葡萄糖特异结合，将信号传导到细胞内，诱导细胞的胞吞和转运，在兔眼结膜上皮细胞模型中表现出较好的促进内吞的作用。
　　【材料、试剂和器具】
　　1.材料 马铃薯块茎，黄豆，兔血，鸡血。
　　2.试剂 PBS缓冲液（pH 7.2），抗凝剂，0.9% NaCl，0.75% NaCl等。
　　3.器具 显微镜，1/100电子天平，载玻片，盖玻片，吸管，5mL移液管，研钵，50mL烧杯，单面刀片，吸耳球，离心管，K2EDTA（EDTA为乙二胺四乙酸）真空采血管等。
　　【实验步骤】
　　1.血液处理
　　（1）兔血。采用心脏采血法，采血2mL至K2EDTA真空采血管内混匀，取50～100μL血液用0.9% NaCl（哺乳类的生理盐水）稀释至3mL。显微镜下镜检，稀释浓度至兔血细胞分散，平均间隔1个细胞体积为佳。
　　（2）鸡血。采用翅下静脉采集法或鸡心脏采血法，采血2mL至K2EDTA真空采血管内混匀，取50～100μL血液用0.75% NaCl（禽类的生理盐水）稀释至3mL。显微镜下镜检，稀释浓度至兔血细胞分散，平均间隔1个细胞体积为佳。
　　2.制备凝集素
　　（1）称取马铃薯去皮块茎4g，切成小块，置于小烧杯内，铺平后沿烧杯内壁缓慢加入10mL PBS缓冲液，浸泡0.5～1h（注意勿摇晃粗提液），浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。
　　（2）取黄豆10粒，压碎成颗粒状（不要研磨成粉末状），置于小烧杯内，沿烧杯内壁缓慢加入10mL PBS缓冲液，浸泡0.5～1h（注意勿摇晃粗提液），浸出的粗提液中含有可溶性大豆凝集素。
　　3.观察细胞凝集
　　（1）用滴管吸取凝集素和红细胞液各一滴至载玻片上，充分混匀，静置20min后盖上盖玻片，镜检观察。
　　（2）用滴管吸取PBS和红细胞液各一滴至载玻片上，充分混匀，作为对照，静置20min后盖上盖玻片，镜检观察。
　　【实验结果】
　　细胞凝集实验结果参见图1.2.1（数字资源1.2.1）。
　　图1.2.1　细胞凝集实验结果
　　【思考题】
　　1.绘制所观察到的细胞凝集效果图。
　　2.大豆凝集素与马铃薯凝集素的细胞凝集现象有何不同？为什么？
　　3.请问伤口流血形成的血疤、市场上买的血制品和本试验的细胞凝集原理相同吗？
　　4.抗凝剂（K2EDTA）是否影响凝集素的细胞凝集？
　　【附录】
　　（1）PBS缓冲液（pH 7.2）：称取NaCl 7.2g、Na2HPO4 1.48g、KH2PO4 0.43g，加蒸馏水定容至1L，调pH到7.2。
　　（2）网络互动实验室光学显微镜的操作与使用视频参见数字资源1.2.2。
　　实验1.3　花粉粒活性染色鉴定
　　【实验目的】
　　了解花粉活力测定的意义，掌握其测定的方法。
　　【实验原理】
　　花粉是有花植物的生殖细胞，外观呈粉末状，其个体称“花粉粒”。不同物种花粉的活力不同。一般来说，菊科、禾本科、十字花科等三核型花粉粒外壁薄，对干燥敏感，寿命较短；而蔷薇科、豆科、兰科等二核型花粉粒具有厚实的外壁，能忍耐干燥，寿命较长。例如，水稻花粉在田间10min后就几乎全部失去萌发能力，玉米花粉寿命仅为24h左右；而杏花粉的自然寿命为19d，苹果花粉寿命为7～8d。温度和湿度等外界因素是影响花粉活力的重要因素，低温和低湿有助于花粉维持较长时间的活力。花粉的分类参见数字资源1.3.1。
　　在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良，以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的重要基础。
　　1.TTC染色法 TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物。它是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，能与正常组织中的脱氢酶反应，将TTC还原成不溶性的稳定的TTF（呈红色）。具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH和NADPH可以将无色的TTC还原成红色的TTF，无活力的花粉呼吸作用较弱，TTC颜色变化不明显（图1.3.1）。
　　图1.3.1　TTC染色原理
　　2.Alexander染色法 Alexander染色法是判断花粉活力的一种简便的方法，其染色液中的孔雀石绿可以使得纤维素构成的细胞壁着色，而酸性品红可使花粉原生质着色。如果花粉是可育的、有活性的，则花粉被染成紫红色；如果花粉是无育性的或死亡的，原生质的特性已发生变化，染色后呈现苍白色或青蓝色。
　　3.碘-碘化钾（I2-KI）染色法 多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往淀粉积累较少或不含淀粉，I2-KI溶液染色后呈黄褐色。因此可用I2-KI溶液染色来测定花粉活力。
　　【材料、试剂和器具】
　　1.材料 百合花药。
　　2.试剂 TTC染液（I2-KI溶液，Alexander染液）等。
　　3.器具 电磁炉（配搪瓷缸），光学显微镜，载玻片，盖玻片，吸水纸，纸抽，移液器，移液器吸头，1.5mL EP管，EP架，记号笔，标签纸卷，解剖镜，刀片，镊子，解剖针等。
　　【实验步骤】
　　实验步骤以TTC染色法为例，其他染液染色步骤相同，使用的染液不同。
　　（1）取百合花药并拍照记录花药开放程度，取花药中部切成2～3mm长小段，取相邻两小段分别放置在1.5mL EP管内。
　　（2）对照处理：取其中一管，加入200μL蒸馏水，100℃煮3min，用解剖针轻轻搅拌，使花粉从花药中掉落，弃花药壁，静置5min，小心吸出蒸馏水，加入50μL TTC染液，染色15min。
　　（3）取另一支EP管，加入50μL TTC染液，用解

目录
第五版前言
**章　基础细胞生物学实验1
实验1.1　细胞膜的渗透性1
实验1.2　细胞的凝集反应3
实验1.3　花粉粒活性染色鉴定5
实验1.4　叶绿体和细胞核的密度梯度分离7
实验1.5　细胞器的超活染色观察9
实验1.6　植物细胞骨架的光学显微镜观察11
实验1.7　果蝇诱捕和巨大染色体的观察13
实验1.8　孚尔根染色法14
实验1.9　血涂片的制备与显微观察16
实验1.10　植物原生质体的制备及瞬时转化17
实验1.11　植物细胞质膜的分离和纯化技术19
实验1.12　质膜蛋白分选的膜泡运输观察20
实验1.13　植物细胞程序性死亡的诱导和梯状DNA的观察23
第二章　高级细胞生物学实验26
实验2.1　氯化汞对水通道蛋白的抑制效应观察26
实验2.2　核酸（DNA和RNA）的细胞核定位观察28
实验2.3　微丝骨架的特异性标记30
实验2.4　微管骨架的荧光显微标记实验32
实验2.5　线粒体的特异性荧光标记观察34
实验2.6　GFP-tubulin转基因拟南芥的无菌培养及观察35
实验2.7　流式细胞仪观察细胞周期37
实验2.8　植物细胞胞吞作用及内膜系统的荧光显微镜观察39
实验2.9　Taq酶的提取、分离纯化及酶制剂的制备42
实验2.10　木瓜蛋白酶的提取、活性测定及固定化44
实验2.11　酵母双杂交实验47
实验2.12　酵母单杂交实验49
实验2.13　凝胶阻滞实验51
实验2.14　双分子荧光互补技术55
第三章　植物转基因技术及检测59
实验3.1　多肉植物的无菌培养59
实验3.2　小麦成熟胚愈伤组织诱导60
实验3.3　根癌农杆菌介导的烟草叶盘法遗传转化61
实验3.4　根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化64
实验3.5　发根农杆菌介导的大豆毛状根转化65
实验3.6　基因组DNA的提取67
实验3.7　植物组织总RNA的提取68
实验3.8　核酸浓度和纯度检测71
实验3.9　逆转录PCR实验74
实验3.10　real-time PCR实验76
实验3.11　Southern印迹杂交实验78
实验3.12　萤光素酶报告基因的检测82
第四章　线虫的实验操作84
实验4.1　线虫DNA的提取84
实验4.2　线虫同步化85
实验4.3　线虫总RNA提取86
实验4.4　线虫的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变87
实验4.5　线虫的杂交88
实验4.6　线虫基因型的鉴定89
实验4.7　线虫转基因及整合90
实验4.8　线虫的RNAi实验91
实验4.9　利用CRISPR/Cas9对线虫的基因组进行编辑92
第五章　果蝇的实验操作94
实验5.1　果蝇中肠干细胞的形态与观察94
实验5.2　果蝇S2细胞的培养与转染96
实验5.3　果蝇基因组DNA的提取99
实验5.4　果蝇肠道损伤检测（蓝精灵法）101
实验5.5　果蝇精巢免疫荧光染色102
实验5.6　果蝇凋亡检测（TUNEL法）105
实验5.7　果蝇幼虫脂滴的标记观察108
第六章　动物细胞的实验操作110
实验6.1　HeLa细胞的传代培养110
实验6.2　脂质体介导的外源基因转染HeLa细胞111
实验6.3　HeLa细胞有丝分裂的形态观察113
实验6.4　免疫共沉淀技术114
实验6.5　DNA损伤诱发的焦点形成检测116
实验6.6　中性彗星实验117
实验6.7　细胞核质分离提取技术119
第七章　细胞生物学综合探究实验122
实验7.1　植物促生性芽孢杆菌缓解水稻受土壤镉胁迫的作用123
实验7.2　植物“类神经系统”传递伤害信号的探索研究129
实验7.3　哺乳动物细胞中非**的DSB末端修切途径探索135
实验7.4　跳舞草应对环境刺激产生节律性运动规律的研究141
主要参考文献147
附录150