**章 神经科学研究技术的发展历程
**节 前言
神经科学是一门交叉性很强的学科，研究技术涉及多个学科，从起初主要包括神经化学、神经解剖学、神经生理学、神经药理学等学科，到现今综合了生理学、解剖学、组织学、胚胎学、生物化学、分子生物学、药理学、神经生物学、神经病学、精神病学、心理学、免疫学、遗传学、发育生物学、影像学、计算机网络、认知科学、电子信息学、工程学、光学等多门学科。随着现代社会工作生活方式的改变，神经系统相关疾病的发病率逐年上升，并且备受关注。近年来，神经科学研究迅猛发展，已被世界各国上升到国家战略位置。目前，与快速发展的信息科学和人工智能技术相结合，神经科学研究正迎来飞速发展的阶段，越来越多的不同学科背景的科研工作者积极投身神经科学相关研究中。为便于从事神经科学相关研究的学者了解和掌握本学科常用技术，本书对神经科学常用的技术方法进行了系统总结和梳理。
神经科学研究技术是探索大脑工作机制的基本工具，本书介绍了神经科学研究的核心技术，有望帮助读者了解现代神经科学技术的发展和应用，为神经科学领域研究人员提供可靠实用的方法指南。
第二节 早期神经科学技术的发展
公元前 500年左右，古希腊哲学家提出人有理智和灵魂。但是，由于当时自然科学的发展水平有限，人们把一切精神活动都归于“心”的功能，错误地认为认知的本质是“心脑一体”。直到近代解剖学逐步发展，才让人类真正开始认识自身，并且开启探索大脑秘密、攻克大脑疾病的新纪元。
人类对大脑的科学研究昀初从解剖和观察开始。古希腊医生阿尔克迈翁（ Alcmaeon）和盖伦（Galenus）借助解剖手段，分别发现眼部后方的视神经与大脑相连和神经源于脊髓。 1543年，比利时学者维萨留斯（ Vesalius）绘制了脑室结构。 17世纪，威利斯（ Willis）完成了真正意义上的脑神经解剖。 1786年，意大利医生和动物学家加尔瓦尼（ Galvani）在解剖青蛙时，刀尖意外触碰到去皮蛙腿上外露的神经，蛙腿剧烈痉挛。后经过反复实验，他推测动物体存在电，并称之为“动物电”。加尔瓦尼的偶然发现，为后来的伏打电池的发明和电生理学的建立奠定了重要的认知基础，在科学史上传为佳话。虽然众多技术逐渐被应用于神经科学研究，科学家也开始意识到大脑的重要性，但在当时蒙昧、迷信的时代环境下，脑科学的研究进展非常缓慢。
直到 19世纪，随着“动物电”的发现，以及生物化学、药理学和脑区损毁等相关技术的发展，脑科学迎来了快速发展阶段。 1870年研究者通过电流刺激大脑实验，发现电刺激大脑皮质可以产生“对侧脑半球”的肢体运动，尽管当时并不清楚该现象背后的神经机制。 1873年，高尔基（Golgi）发明铬酸钾-镀银法，在约 100个神经元范围内可有效染出 1个神经元。利用这种方法可以清晰展示着色神经元的全貌，不仅带动了后续显微成像技术的发展，更使人们对神经元的认识前进了一大步。尽管原理仍不清楚，高尔基镀银法至今仍是神经科学中常用的基本方法之一。不久后，卡扎尔（ Cajal）改良了高尔基镀银法技术，在显微镜下观察并描绘了神经元和神经胶质细胞的精细结构和形态。在 Cajal提供的形态学研究基础上，瓦尔德尔（ Waldyer）提出“神经元学说”（ neuron doctrine），为现代神经系统研究开启了一扇崭新的大门。英国分子生物学家谢林顿（Sherrington）则在 Cajal的研究基础上提出，“突触”是神经连接的基本单元，埃克尔斯（Eccles）与克里德（ Creed）利用微电极电生理记录证实了突触结构的真实存在。
早期的神经科学技术以光学显微成像和化学染色技术为主，借此观察大脑结构。随后，又融合了生理学、低分辨电生理学及生物化学技术，开始对神经系统功能进行初步探究。这些卓著的技术和成果共同构筑了神经科学的初步雏形，为现代神经科学的快速发展奠定了坚实的基础。
第三节 现代神经科学技术的发展
20世纪是神经科学技术不断创新和突破的时代，目前使用的技术大都是在此阶段的研发基础上改进而得，很多技术甚至沿用至今。 1925年，科学家埃克尔斯（ Eccles）将微电极插入猫脊髓前角细胞，记录细胞内电活动；并通过记录神经与肌肉接头处的终板电位，证实了突触部位不仅有兴奋性递质也存在抑制性递质，即证实了谢灵顿晚年强调的抑制性突触的存在。随后，研究者又借助微电子技术检测到神经细胞兴奋时的动作电位。然而，这些记录生物电的技术灵敏度低，不足以阐明神经活动的电生理基础。 1929年，德国贝格尔（ Berger）使用生理盐水作为介质，将表面电极置于额部及枕部，**次展示了人类脑电图（ electroencephalogram，EEG）。1952年，霍奇金（ Hodgkin）和赫胥黎（ Huxley）在由科尔（ Cole）和马尔蒙（ Marmont）1947年初设计建立的电压钳基础上，利用电压钳技术对乌贼神经纤维的电脉冲进行记录（乌贼是一种神经纤维大到足以成功插入记录电极的动物），阐明了神经脉冲产生和传播的基本规律。 1976年，德国马普生物物理研究所内尔（Neher）和萨克曼（ Sakmann）创建了膜片钳（ patch clamp）技术。这是一种通过记录离子通道电流反映细胞膜单一或多个离子通道分子活动的电生理技术，与基因克隆（ gene cloning）技术共同给整个生命科学研究带来了巨大的推动力，至今仍被广泛应用于神经科学和其他生命科学研究中。 20世纪 80年代，激光共聚焦及双光子激光扫描显微镜成像技术飞速发展，结合荧光染料、荧光蛋白和荧光显微成像等技术，实现了对大脑深层组织的高分辨率动态可视化观察。 20世纪 90年代，功能性磁共振成像技术则实现了对活体大脑神经活动区域的无创性成像，推动了人们对脑感知等初级脑功能的认识，成为深入研究运动、学习、记忆等高级脑功能的重要工具。进入 21世纪后，研究者更加注重开发高分辨率、高通量和高特异性的技术，用以实现对神经细胞的精确观察和操控。此外，为了实现对神经细胞钙浓度变化和神经递质释放的动态可视化监测，相应特殊的荧光染料或者神经递质荧光探针被相继开发。昀初的活体钙 /神经递质释放的活体检测受设备成像的深度制约，仅适合对体外培养细胞和脑片进行实时记录。为进一步提高成像深度和降低成像背景噪声等，以便满足对大脑深层的检测需求，双光子、多光子成像技术逐一问世。其中，利用三光子显微镜，可以获得超过 1mm深度的脑组织图像（ Streich et al.，2021）。在读取大脑神经元语言和解码神经细胞信息编码方面，多通道胞外电生理记录等技术逐步问世，还开发出钙成像和磁共振成像联用技术，同时进行二维的钙成像和三维的磁共振成像，帮助研究者更加全面深入研究大脑功能（ Lake et al.，2020）。
该时期另外一个代表性的关键技术是“光控遗传技术”。为了实现通过无损伤或低损伤的高时空分辨率操控特定神经元的活动并研究其功能，斯坦福大学迪赛罗斯（Deisseroth）研究团队在 2005年成功利用光敏感通道对哺乳动物神经细胞进行了光操控（ Boyden et al.，2005）。该技术结合光学及遗传学技术，通过遗传学方法将合适的外源光敏感蛋白靶向导入特定活细胞，利用特定波长的光照刺激光敏蛋白，调控神经元的活性，进而控制神经网络功能及动物行为，是目前研究神经环路、行为、神经精神疾病等的重要工具。
此外，脑光学成像技术近年也取得了重要进展。为克服传统脑片研究的局限性，能够在全脑水平精细解析神经网络组成、投射、连接以及活动模式，Deisseroth团队开发出组织透明化技术。借此技术，科研人员可以快速便捷地实现单细胞精度的神经细胞的全脑成像（ Epp et al.，2015）。在神经环路解析方面，利用基因编辑技术改造的重组病毒载体可靶向标记特定神经元，通过顺行和逆行示踪方式研究神经环路的连接和组成（ Xu et al.，2020）。随着神经科学研究不断地深入，科学家发现大脑神经元具有高度的组成和功能异质性。为精细解析环路细胞的分子特征，转录组学技术也在近年被应用于神经元亚群的分类和功能鉴定。随着计算机技术近年的深入发展，机器学习和视觉学习等先后被广泛应用于神经科学中大规模神经网络活动分析解码、自动化行为学分析、神经网络活动数学建模等，进一步促进了脑科学全方位的快速发展，也为脑机接口和人工智能的深入研发奠定了基础。
技术方法的不断变革与创新是促进自然科学发展的重要因素。相较其他学科，神经科学的发展更加依赖相关研究技术的进步。因此，了解各种技术在神经科学中的发展和应用对脑科学研究至关重要。近年来，低损伤、高度特异性、高度分辨率的技术不断问世，帮助神经科学研究者逐步阐明感觉系统（视觉、嗅觉、味觉、听觉、感觉）的工作原理，并在脑信息传递和优化处理的机制，以及神经精神疾病（如癫痫、抑郁症、帕金森病等）发生的机制解析方面取得了一系列重要进展。
第四节 我国神经科学技术发展概况
我国的神经科学研究工作起步于 20世纪 30年代，神经科学家林可胜、冯德培、汪敬熙、朱鹤年、蔡翘等作为我国神经科学发展的奠基者，将西方神经科学的种子带回国，*次在国内开展神经解剖学与神经生理学等工作，由此神经科学在中国大地发芽并快速成长。 1961年，冯德培、张香桐、刘育民等上海生理研究所的研究人员组织开展神经电生理训练班。 1979年脑研究所组建成立，张香桐院士任所长。 1999年，中国科学院正式建立神经科学研究所，蒲慕明院士任所长。正是得益于众多神经科学家在神经科学领域的科研和教学工作方面做出的突出贡献，并培养出一大批研究神经科学的骨干，我国神经科学才能够顺应国际趋势，蓬勃发展。
经过一代又一代脑神经科学家几十年来的不断努力，中国脑科学正在高速发展。然而，与起步较早的发达国家相比，在科研成果的发表与专利申请等方面仍有较大差距。特别是新型技术的研发方面，我国在神经领域研究使用的技术和仪器，大都借鉴发达国家或依靠进口，相关核心前沿技术受国外政府或机构管制出口，一定程度影响了我国神经科学技术的自主创新。但我国科学家奋力直追，已经或正在相关领域作出重要突破。比如 2017年北京大学程和平院士团队成功研制了新一代微型化双光子荧光显微镜。它仅有 2.2克重，可佩戴在实验动物的头部颅窗，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号，性能优于美国研发的微型化宽场显微镜（ Zong et al.，2017）。同年，华中科技大学的骆清铭教授团队成功研发了荧光显微光学切片断层成像（FMOST）技术，该技术可实现高分辨率单细胞水平快速绘制脑图谱（ Gong et al.，2016）。2018年，清华大学戴琼海院士团队研制出新型超宽视场、高分辨率的实时显微成像仪（ RUSH），具有高时空分辨率多维连续成像能力，可实现活体动物脑神经细胞的“全局形态”和“细节特征”的多维度观测。 2019年中国科学院深圳先进技术研究院的郑海荣及其团队，成功研发基于超声辐射力的深部脑刺激与神经调控仪器，利用超声波无创到达大脑深部操控灵长类动物和人类神经元活动，为研究脑疾病机制提供了强有力的研究工具（Huang et al.，2019）。2020年，神经科学国家重点实验室王凯研究组成功研发新型扩增视场光场显微镜，弥补了共聚焦显微镜和双光子显微镜在活体脑成像时，时间分辨率低和难以捕捉大范围脑区神经元的快速变化等缺点（ Zhang et al.， 2021）。2021年，骆清铭院士团队继续开发了线照明调制显微术并实现了高清成像，该技术被称为高清荧光显微光学切片断层成像技术（ high-definition fluorescent micro-optical sectioning tomography，HD-FMOST）。该技术解决了传统荧光显微光学层析成像方法无法同时兼顾高分辨率、高通量和高清晰度的问题，将全脑光学成像从高分辨率提升到高清晰
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