循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）作为重要的预后指标和液体活检的主要材料来源之一，对肿瘤患者的微小残留病变监测、预后判断、疗效预测和转移进展机制研究有非常重要的价值。《循环肿瘤细胞：液体活检技术进展(第2版，中文翻译版）》汇集了几十位液体活检领域的全球**学者，从液体活检技术、技术开发、生物学原理、临床应用、预后与疗效监测、下一个前沿等六个方面对以CTC为代表的肿瘤液体活检做了全面系统介绍，并在第1版的基础之上，增加了液体活检中循环肿瘤DNA和细胞外囊泡的相关内容。《循环肿瘤细胞：液体活检技术进展(第2版，中文翻译版）》对于该领域的良性发展有很好的启发和推动作用。

**部分液体活检技术
　　第1章 基于循环肿瘤细胞的液体活检与诊断性白细胞分离术
　　NikolasH.Stoecklein
　　摘要 循环肿瘤细胞（circulating tumorcell，CTC）作为组织标本的理想替代，可以提供全身性癌症的分子特征，用于制定合理的治疗决策。然而，CTC在液体活检中的全部潜力目前受到其低检测频率和不可靠检测结果的限制，即使在转移性癌症患者中也面临这一问题。导致低检测频率的主要原因在于传统血样的体积较小，无法代表全部血容量，而稀有的CTC在血液中的分布并不均匀。为解决这一问题，临床上需要安全且舒适的大血容量分析，白细胞分离术（leukapheresis）因此成为一种潜在的解决方案。本章的目的是向读者介绍诊断性白细胞分离术（diagnostic leukapheresis，DLA）从大量血液中收集CTC的理论依据、基本原理、初步应用及现有的挑战，以提升CTC的检测与分析能力，为科研及潜在的临床应用提供支持。
　　关键词 循环肿瘤细胞；CTC；液体活检；大血容量分析；诊断性白细胞分离术；DLA；血液成分部分清除
　　1.1 引言
　　液体活检（liquid biopsy，LB）的前景在于通过简单的血液采样来补充甚至替代组织
　　活检，尤其是在靶向治疗时代，需要及时获取癌细胞特征的分子信息。液体活检是一种微创手段，能够进行反复全面的诊断，并提供全身性癌症临床相关分子特征的可靠信息[1]。癌症患者已经能够从进入临床常规的液体活检中受益，例如，在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中，通过EGFR ctDNA检测可以避免侵入性组织活检[2]。然而，*具潜力的液体活检方法之一是从外周血中直接分离CTC，并将其作为癌症组织的替代物。从血液中分离出的癌细胞可以提供全谱分析物，包括蛋白质、DNA和RNA，从而有利于开展多样化的临床相关诊断[1]。事实上，从技术上已经能够对CTC中的所有分析物（也可以组合起来）进行检测，甚至低至单细胞水平[3]。然而，由于CTC的低检测频率（即使在转移性癌症患者中，CTC阳性率仅为50%～70%），其检测并不可靠，这是其临床常规应用的主要障碍。检测频率低的一个主要原因是传统液体活检采样管中的样本体积较小，约为10mL，无法代表人体内循环的全部血容量[4]。因此，多个研究团队开始探索大体积液体活检，以显著提高捕获到足够数量的稀有CTC的机会。本章的目的是向读者介绍大血容量分析和诊断性白细胞分离术的新方法，这些方法能够分析数升血液中的CTC，并提供这些技术近期在不同癌症中应用的初步数据信息。
　　1.2 基于CTC的液体活检中使用大血容量的基本原理
　　CTC在全血中的浓度通常极低，比血细胞的浓度低几个数量级[4]。每个患者体内的CTC数量因人而异，理论上某个患者在某个时间点上可以有1个到数百万个CTC。全血容量是指在任何时间内流经动脉、毛细血管、静脉、小静脉和心脏腔室的全部血液量，成人为4～6L[5]。除了在肺癌患者中获得的数据表明CTC在通过心脏和大血管时比在外周微循环中更易丢失外[6，7]，关于人类患者中CTC释放入血流及其浓度动态变化的相关信息目前知之甚少[8]。根据少量在肿瘤引流静脉中检测CTC浓度的报告，肿瘤细胞的扩散速率估计为每小时每克肿瘤90～78000个CTC[8]。根据CTC阳性患者中所报道的检测率（即CellSearch系统中检测到≥1个CTC）[9]，大多数患者的CTC浓度范围为总血容量5～250000个肿瘤细胞[4]。影响CTC浓度的重要因素包括肿瘤类型、肿瘤细胞总负荷、肿瘤分期及转移部位[10]。例如，与器官局限性乳腺癌患者（可能＜5个CTC或CTC阴性）相比，骨转移的乳腺癌患者具有高数值（＞5个CTC/7.5mL），CTC阳性检测结果的可能性更高。在传统的7.5mL外周血样本中检测少量CTC极具挑战性，因为其背景中含有大约4500万个白细胞（white blood cell，WBC）以及数十亿个红细胞和血小板。其他文献中对为实现此目标的各种CTC检测方法已进行了广泛综述[11-14]。值得注意的是，初始富集步骤是必要的，可以减少血液细胞的背景。CTC与有核WBC的分离是*具挑战性的，通常通过分子标志物或生物物理特性来实现[4]。尽管仍有改进空间，CTC富集和检测的灵敏度已经非常高，有些技术的精准度甚至已达到可以在血液样本中检测到单个CTC。然而，尽管灵敏度很高，CTC的低检测频率仍然限制了它作为伴随诊断或可靠地替代组织活检的应用。
　　CTC的低检测频率有几个潜在原因（如CTC的分子和生物物理异质性），但主要原因很可能是常规外周血样本的低容量。早在1961年，Roberts及其同事就在其关于血液中癌细胞循环临床意义的论文中提到：“除了在处理过程中的细胞丢失，大量的采样误差也导致了总数的失真。10mL等分的血液样本很难被视为总血容量的合理指标。必须在频繁的间隔内采集血样，以检测癌细胞的‘局部阵雨’（isolated showers）”[15]。虽然系统性的CTC研究当时还处于起步阶段，并且没有敏感的检测方法，但他们已经认识到CTC在总血容量中的不均匀分布的重要性。Tibbe及其同事通过数学模型很好地描述了这个问题，证明了泊松分布（Poisson distribution）效应，这种分布适用于在大血容量中计数随机分布的CTC[16]。由于这种随机分布，检测到细胞的概率下降了约40%。检测方法的有效性和观察者间的变异性进一步降低了这一概率。例如，如果假设总血容量为5L，并且有1000个上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）阳性的癌细胞在其中循环，则在CellSearch检测7.5mL血样时，检测到其中1个细胞的概率约为35%。如果检测的血液量增加到45mL（即6次CellSearch检测），检测到至少1个CTC的概率将上升到95%[16]。因此，增加采样的血容量显然提高了在整个循环血容量中检测到不均匀分布CTC的机会。*初的尝试是分别在早期乳腺癌和结直肠癌中增加检测的血液量，分析30mL血液而不是7.5mL[17，18]。然而，这需要4次并行CellSearch检测，成本相当高。为了展示CTC的转移能力，在转移性乳腺癌患者中还进行了开创性的异种移植实验，从患者中抽取的血液量增加到了50mL，这些患者在先前的7.5mL血液检测中呈阳性[19]。
　　然而，要实现更可靠的CTC检测，必须分析更大体积的血液。Coumans及其同事通过对不同转移性癌症类型两个不同时间点（基线和**次随访）的CellSearch数据进行回归建模，估算了所需的血液量[20]。在拟合分布函数后，数据被外推至5L的血容量。这些计算表明，在5L血液中，超过98%的转移性癌症患者至少有1个CTC（在**次治疗后，这一比例下降95%以上）。如果分析至少1L的血液，则超过80%的患者应检测到10个或更多个CTC。*立研究团队的类似建模得出了相似的结论，认为需要分析1L的血液，才能以99%的概率检测到超过50个CTC[21]。现有的模型和数据共同表明，规模达到“升”级别的血液分析对于更可靠的CTC诊断至关重要。这引出了一个问题：在不损害患者的前提下，这种方法在技术上是否可行。因此，下一节将简要概述白细胞分离术，解释为什么这种标准的血液分离方法是进行大血容量CTC分析的有前景且安全的工具。
　　1.3 白细胞分离术使大血容量CTC分析成为可能
　　如今白细胞分离术所用的主要细胞分离技术源于1962年IBM工程师George Judson的个人悲剧，当时他的儿子患上了慢性髓系白血病[22]。治疗中他目睹了从患者血液中分离白血病细胞的繁琐过程。于是，Judson向美国国家癌症研究所（NCI）的主治医生Emil Freireich提供帮助，制造一种设备以简化这一过程并提高患者的舒适度[22]。随后，IBM与NCI合作并*终研发出一种自动化的连续流动离心血液分离器，不仅能够减少和收集WBC，还可以进行血浆或红细胞的交换[23，24]。如今，这种多功能机器已经成为标准设备，用于每年超过1000万次（基于血液成分部分清除的）献血[25]。此外，自动化血液分离器还成为通过白细胞分离术从外周血中采集造血干细胞用于移植的基石，如今这种方法已在全球每年超过5万次移植中广泛取代了骨髓抽取[25]。白细胞分离术的其他治疗性应用还包括为癌症免疫调节疗法（如过继免疫疗法）采集淋巴细胞，以及用于治疗急性白血病引起的高白细胞症（白细胞计数或原始细胞计数超过100000/μL），尤其是在出现白细胞淤滞时[26，27]。因此，治疗性白细胞分离术作为从数升血液中采集WBC的工具被常规使用，并被认为在临床上是安全的，与不良反应几乎无关。报道的不良反应主要与穿刺相关，例如需要在外周部位重新插入穿刺针或出现局部血肿[28]。中度不良事件主要表现为白细胞分离术使用枸橼酸钠时出现的刺痛感，因为含枸橼酸钠的血液被回输到患者体内，阳离子的螯合作用会继续发生在全身循环中，可能导致伴随症状的代谢并发症（如低钙血症）。然而，严重不良反应罕见[28]。特别是这个过程在相对较短的时间（约1小时）内进行且事先未经干细胞动员[如未使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）]。
　　理解白细胞分离术如何用于CTC富集，*先需要简要了解该方法的基本原理。白细胞分离术是在一个血液连续流动的程序中通过细胞大小和密度离心分离白细胞[23，24]。患者
　　通过两条外周静脉导管（peripheral venous catheter，PVC）连接到血液分离机器，导管通常放置在两侧肘静脉（也可以使用中心接口）。通过PVC患者的血液进入机器，其间血液会经抗凝处理，并进入旋转离心机（图1-1）。由于逆时针流动，密度较高的血细胞如红细胞会向通道外部迁移，血浆漂向中心，而白膜层则移向中心（图1-2）。然后，通过连接器可以从距离通道中心的不同位置的端口中抽取部分目标血液（图1-3），并将其收集到血袋中。在目前主要用于DLA的有Spectra Optia系统，该系统的连接器配备了一个分液坝，以减少白细胞在冲洗阶段返回供体的概率。界面位于采样端口下方，使得白膜层被保留在连接器中而不返回患者体内。此外，红细胞返回端口设置在连接器较高的位置，因此在冲洗腔室时吸取的是血浆，而不是可能富含白细胞的红细胞部分[30，31]。剩余的血细胞和血浆通过连接在对侧手臂上的PVC回输到患者体内。白细胞分离术主要收集的白细胞是单核细胞（mononuclear cell，MNC），其密度范围为1.055～1.08g/mL[4]。尽管CTC的确切密度尚不明确，但来自密度梯度离心实验、*新的生物物理分析和计算得出的数据清楚表明，上皮细胞的密度与单核细胞的密度有很大的重叠[4，32-35]。因此，在白细胞分离过程中，CTC会与MNC一同被收集（图1-2）。由于在20世纪90年代和21世纪初，白细胞分离术与造血干细胞移植成为治疗晚期乳腺癌高剂量化疗策略的一部分，有关白细胞分离产物中混入CTC的数据是能够获取的[4]。实际上，大多数研究人员都发现并讨论了混入CTC的问题。当时通过各种非标准化的免疫细胞化学或聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测手段确定的混入频率和程度高度可变（10%～90%），但确实存在（见综述[4]）。有趣的是，一项涵盖17项研究的荟萃分析显示，在1819名患者中，检测到自体干细胞产物中混入CTC的乳腺癌患者与更高的复发率显著相关，这表明与干细胞一起被不经意回输的活性癌细胞可能导致高剂量化疗后的疾病进展[36]。与此数据一致的是，一项基于PCR的研究发现，患者所接受的干细胞产物中如果混入了表达上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal t

目录
**部分 液体活检技术
第1章 基于循环肿瘤细胞的液体活检与诊断性白细胞分离术 3
第2章 利用核酸酶辅助消除野生型DNA富集液体活检样本中的微量等位基因 17
第3章 利用外泌体进行癌症诊断和治疗 27
第4章 细胞外囊泡在生物医学中的转化机遇 34
第5章 癌症相关循环细胞外囊泡的捕获和浓缩 54
第6章 循环肿瘤细胞与肿瘤来源外泌体 66
第二部分 技术开发
第7章 数学肿瘤学：整合多模态临床和液体活检数据用于生存预测 83
第8章 微流控、循环肿瘤细胞捕获、分析和扩增 104
第9章 用于液体活检的分子检测的开发与验证 120
第10章 循环肿瘤细胞增殖技术的*新进展 148
第三部分 生物学原理
第11章 循环肿瘤细胞的转录组分析 167
第12章 通过单个循环肿瘤细胞测序和CDX分析了解肿瘤内异质性 180
第13章 乳腺癌和卵巢癌中单个循环肿瘤细胞的分子分型 195
第14章 循环肿瘤细胞分离和分子图谱及潜在治疗干预 212
第15章 乳腺癌和前列腺癌模型中循环肿瘤细胞的分子特征解析 227
第四部分 临床应用
第16章 创建应用于液体活检的带注释信息的生物样本资源 241
第17章 应对精准医学的挑战：液体活检的机遇 262
第五部分 预后与疗效监测
第18章 早期乳腺癌中的循环肿瘤细胞 275
第19章 黑色素瘤脑转移患者中血浆cfDNA和cfmiRNA标志物的NGS分析 292
第20章 ctDNA 与肺癌 306
第21章 在转移性乳腺癌中应用液体活检的临床前景 320
第22章 前列腺癌治疗患者的循环肿瘤细胞 334
第23章 液体活检在脑肿瘤中的作用 340
第六部分 下一个前沿：液体活检和早癌检测
第24章 早癌检测：挑战与机遇 363
第25章 Galleri测试 371