概述
一、白细胞介素18的研究进展
（一）IL-18的发现
1982年，Okmura等发现痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)与丝裂原LPS合用能显著增加IFN-γ的分泌水平，推测有中介因子参与，但一直未能确定。1989年，Nakamura等从痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)和细菌脂多糖(LPS)致内毒素休克的小鼠血清中分离出一种具有诱导产生IFN-γ活性的蛋白因子，研究发现，这种因子与IL-12有很多相同之处。1995年，Okamura等发现用Pacnes处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-γ。随后用Pacnes接种小鼠，再用LPS诱导小鼠使其中毒休克，从其肝脏提取液中分离到一种均一多肽，约18KD。根据其中两个多肽片段的氨基酸序列合成寡核苷酸引物，以此为引物用RT-PCR将从小鼠肝脏中提取的mRNA扩增出一个不完全的cDNA片段，作为探针，筛选小鼠肝细胞cDNA文库，得到一全长的cDNA克隆，并在大肠杆菌中表达。因其可诱导IFN-γ产生，命名为γ-干扰素诱导因子(interferon gamma inducing factor,IGIF)(Okamura et al,1995)。1996年，Ushio等用鼠IGIF cDNA作为探针，从正常人肝脏cDNA文库中分离出人的IGIF cDNA。并在大肠杆菌(Ecoli)中表达，鉴于IGIF的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白质均不相同，并且它除了能诱导IFN-γ产生外还有多种生物学活性，因此重新命名为白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)(Ushio et al,1996)。
（二）IL-18的分子结构
鼠IL-18(mIL-18)前体蛋白由192个氨基酸组成分子量238ku，N末端有一结构特殊的35个氨基酸组成的信号序列，无N端糖基化位点、无野生型疏水信号肽样位点。成熟mIL-18由157个氨基酸组成，分子量182ku，等电点PI = 49(Okamura et al,1995)。IL-18前体与IL-1β前体相似，没有生物学活性。但两者都有IL-1β转换酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE or Caspase-1)的加工位点天冬氨酸残基(Asp)，ICE可选择性地在特异性的位点切割，使之成为有活性的成熟蛋白(Ghayur,et al,1997;Gu et al,1997;Lorey et al,2004;Nagata et al,2002)。目前认为，小鼠的裂解位点是35Asp- 36Asn，人的IL-1β切割位点是36Asp-37Tyr。实验证明，ICE缺失的小鼠可以生成IL-18前体，但不能将其转换成有活性的IL-18。LPS不能在这种小鼠诱导生成IFN-γ(Fantuzzi et al,1998;Melnikov et al,2001)。另一方面，参与细胞凋亡的Caspase-3也能将IL-18前体蛋白和成熟体蛋白降解成无活性形式的降解型副产物，这也可能构成了IL-18一种潜在的负调节机制(Akita et al,1997;Ghayur et al,1997)。据报道，Proteinase-3也可以激发Pro-IL-18的生物学活性。但是，相比而言，Pro-IL-18或者成熟IL-18在76Asp-77Asn以及71Asp-72Ser之间被Caspase-3切开则产生了无活性生物肽(Sugawara et al,2001;Pirhonen et al,1999)。人白介素18(hIL-18)基因编码193个氨基酸前体蛋白，与mIL-18有65%同源性，N端也有类似的信号序列，亦无N端糖基化位点和疏水信号肽位点(Ushio et al,1996)。mIL-18和hIL-18都有IL-1类似的特征性结构(称为IL-1特征样序列)：phe-x(12)-phe-x-ser-x(6)-phe-leu。IL-18的空间结构由12股β片形成β-三叶折叠，这也与IL-1蛋白家族空间结构类似(Bazan et al,1996)。mIL-18可能定位于小鼠9号染色体糖尿病易感基因Idd2区间，推测hIL-18可能定位于IL-1β基因所在染色体2q13区间(Rothe et al,1997)。IL-12能诱导转录信号传导和激活Stat家族蛋白的Stat3、Stat4酪氨酸磷酸比，但用IL-18处理Th1细胞后Stat4酪氨酸磷酸比现象消失。这说明确切的IL-18信号传导路线尚在探索中。折叠识别分析表明，IL-18的蛋白质序列与IL-1β有19%的同源性，与IL-1α有12%的同源性。二者的空间结构是β折叠链，2个发夹结构，故整个结构共有12条反向平行的β折叠链和6个发夹结构。其中6条β折叠链、3个发夹结构形成一桶状结构，其中央是一个巨大的疏水核心，而另6条β折叠链和3个发夹结构在桶底部作三角形排列，形成一个“桶盖”。由于IL-18与IL-1有很多相似之处，两者可能来源于相同的祖先，故有人建议将IL-18命名为IL-1γ。
（三）IL-18的分布及产生
免疫或非免疫细胞都可产生IL-18，人和鼠的IL-18主要由巨噬细胞产生，如单核巨噬细胞，肝脏Kupffer细胞等。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18。小鼠的IL-18主要由肝脏中的Kupffer细胞产生，外周血单核细胞经LPS刺激也有IL-18 mRNA的表达。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18(Gracie et al,2003;Wheeler et al,2003)。人IL-18的细胞来源还不确定，外周血中只有单核巨噬细胞不经诱导即可表达IL-18mRNA，而T、B细胞中几乎检测不到。ConA或PHA刺激的外周血中IL-18mRNA的表达量没有明显改变，提示人IL-18可能来源于单核巨噬细胞系统(赵丽等,2006)。
机体许多器官和细胞都可以检测到IL-18 mRNA，如肝、肾、脾、胰、骨骼肌、肺、成骨细胞、皮肤的角质细胞、活化的巨噬细胞等。在生理条件下，人血液中就含有的IL-18浓度可达50～150ng/L(Taniguchi et al,1997)。鼠肾上腺皮质、垂体后叶(神经垂体)(Conti et al,1997)、肠上皮细胞等非免疫组织都有IL-18的分布和表达(Takeuchi et al,1997),提示IL-18可能作为一种神经免疫调节剂起作用。人成骨细胞、关节软骨细胞也产生IL-18，它在此可能参与骨质代谢过程。
不能肯定IL-18是否以成熟活性形式分泌，因为proIL-18没有保守的信号肽。Gu等(1997)发现用proIL-18表达质粒转染COS细胞有近10%的成熟IL-18分泌，而ProIL-18却不到1%。这可能是IL-18以成熟功能形式分泌的一种证据。但此种分泌机制不清楚。Stoll等(1998)用RT-PCR及细胞剔除的方法证明小鼠角朊细胞或其细胞系PAM212能表达IL-18 mRNA，而且发现过敏原能刺激IL-18 mRNA的表达及有活性的IL-18的产生。这一发现与表皮角朊细胞能影响T细胞向TH1/TH2偏轨相符，也与它们产生ICE相符。
（四）IL-18的生物学功能
1.IL-18促进细胞因子的分泌
IL-18可以诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ，这是它最主要的一个生物学功能。IL-18通过IRAK/TRAF6信号途径，使NF-κB和AP-1在细胞核内与IFN-γ基因启动子中特定的DNA调节序列相结合，激活IFN-γ启动子，从而使IFN-γ基因表达和蛋白合成(Dinarello et al,1998;Pavlova et al,2008;Shi et al,2010) 。在抗CD3分子单克隆抗体存在下，mIL-18可显著刺激鼠Th1细胞产生IFN-γ，并且活性比IL-12高。IL-18与IL-12联合作用时产生IFN-γ比IL-18或IL-12单独作用所产生的多，二者具有协同效应。此协同作用主要是由IL-12诱导T细胞表达IL-18Rα及随后的IL-18上调IL-12Rβ2相互作用所介导的(Yoshimoto et al,1998;Chang et al,2000)。实验表明，在培养液中加入鼠IL-12中和抗体不能抑制IL-18诱导Th1细胞产生IFN-γ，提示IL-18的活性不依赖于IL-12。同样，加入IL-18中和抗体也不能抑制IL-12诱导产生IFN-γ。当IL-12的作用达到饱和时，IL-18的加入依然可以发挥作用，由此说明这两种细胞因子通过不同的信号传导途径，独自起作用。IL-18除可以诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ外，有研究表明IL-18和IL-12共同作用时可使抗CD40分子抗体活化的高度纯化的鼠B细胞产生IFN-γ(Yoshimoto et al,1999)。来源于鼠骨髓的巨噬细胞在IL-12和IL-18刺激下也能产生大量的IFN-γ。由此可见，巨噬细胞不仅可以通过产生IL-12和IL-18刺激T细胞、NK细胞和B细胞产生IFN-γ，并且其自身在IL-12和IL-18作用下也产生IFN-γ。此外，IL-18还可以刺激T细胞产生IL-2(Xu et al,2008;Tang et al,2008)、GM-CSF和TNF-α，外周血单核细胞在IL-18刺激24h后，可检测到有IL-1β和IL-8的产生(Puren et al,1998)。嗜碱性粒细胞和肥大细胞在IL-3和IL-18刺激下也可产生IL-4和/或IL-13。 CD4+静息T细胞与IL-18和IL-2共同培养时，可产生大量的IL-13和少量的IL-4，若用抗CD3分子单克隆抗体刺激培养物，可增加它们产生Th2型细胞因子的能力。并且，这些活化的T细胞可极化为Th2细胞(Yoshimoto et al,1999;Nakanishi et al,2001)。由此可见，IL-18不仅在Th1反应中有重要作用，而且在Th2反应中也发挥一定作用，是一种多功能型的细胞因子。IL-18的功能还包括诱导IL-1β肿瘤坏死因子α和几种趋化因子的分泌。
2对T细胞的作用
IL-18对T细胞表达细胞因子有显著的影响。重组人IL-18(rhIL-18)对T细胞具有促增殖作用。在经CD3单克隆抗体刺激的富集T细胞中加hIL-18，T细胞增殖作用显著增强(纪丽丽等,2005)，且呈剂量依赖性，若rhIL-18浓度较低(10 ng/mL)时，这种促增殖作用可被抗IL-2抗体所抑制，IL-18能促进CD3刺激的T细胞分泌IL-2。酶联免疫吸附分析表明重组的IL-18可刺激T细胞和外周血单核细胞产生大量的IFN-γ(Greene et al,2000)，其效能超过IL-12。联合应用IL-18和IL-12可使体外培养的T细胞产生大量的IFN-γ，其效果优于任何一种因子的单独作用，说明这两种因子诱生IFN-γ的途径可能不同。 IL-18还可以显著的增加培养的T细胞的IL-2的产量，与IL-12不同的是IL-18在没有抗原或CD3刺激存在的时候也可以刺激T细胞产生IL-2，IL-18的这种刺激作用可能是通过活化NF-κB实现的。总之，IL-18促进T细胞的增殖的效应明显是通过一种IL-2依赖途径进行的(Micallef et al,1996)。对鸡脾淋巴细胞，鸡IL-18不需要IL-2的共刺激，就可以刺激T细胞增殖(Gobel et al,2003)。至于IL-18是否参与Th细胞的分化，已有结果表明IL-18不能诱导初始CD4+T细胞向Th1细胞分化，但可能通过促进IL-12来诱导向Th1细胞分化(陈湘琦等,2005)。此外，有人发现在混合淋巴细胞培养开始时即加入IL-18能增强同种异体T细胞的细胞毒性(Dinarello et al,2003)。
3对B细胞的作用
抗IL-18抗体和IL-12抗体都能抑制抗原和抗原提呈细胞(脾脏B细胞)刺激后的Th1细胞产生IFN-γ，并且两种抗体没有交叉反应性，这表明Th1细胞与抗原提呈细胞相互作用时有IL-18和IL-12的产生(内源性释放)(Kohno et al,1997)。Hoshino等(1999)发现IL-18转基因鼠体内B细胞数目减少，但IgE、IgG等含量却上升。也有实验发现IL-12能轻微抑制从脾细胞提取纯化的B细胞的分泌功能，而IL-18没有作用，当IL-18与IL-12一起刺激时可明显抑制Ig的分泌，并且可促使CD40抗体活化的B细胞分泌IFN-γ，产生的IFN-γ不抑制B细胞的增殖，但可抑制IgE、IgG1的生成，同时提高IgG2a的表达量。提示IL-18可能阻断由IgE介导的过敏反应。其机制可能是通过上调B细胞表面的IL-18R。
4增强细胞毒作用
IL-18通过细胞毒作用途径在清除病毒过程中发挥部分作用(Sekiyama et al,2005)。IL-18可上调NK及CD8+T细胞的细胞毒作用，NK与CD8+T细胞一样以多种形式、利用不同的分子发挥它们杀细胞的作用。首先是利用胞吐杀细胞物质穿孔素；第二，效应细胞上FasL的表达诱导有Fas的靶细胞凋亡；第三，TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是新近发现的与多种表达有TRAIL受体的肿瘤细胞相关的细胞毒机制。IL-18可上调穿孔素依赖的细胞毒机制和FasL的表达，但不增加TRAIL的表达，另外因IFN-γ可激活NK细胞，IL-18增强NK活性可能也通过IFN-γ介导的方式(Tsutsui et al,1997)。IL-18与IL-12在上调细胞毒方面没有协同作用。IL-18 缺乏的小鼠，其NK功能下降，给予外源性IL-18，不仅可恢复NK功能且可增强其溶细胞的活性。同时因IL-18可上调IL-18Rβ的基因表达，给予外源性IL-18还可上调IL-18R缺乏小鼠体内NK的活性。
5.IL-18的免疫调节作用
IL-18对机体的免疫反应具有双向调节作用，分为增强和减弱两方面。所谓免疫增强是指用人为措施，全面或选择性提高机体的免疫功能，以达到治疗疾病的目的。增强( enhancement)过去又称刺激( stimulation)，是刺激机体自身免疫系统，激活或调动机体的免疫功能潜能，是一种主动免疫过程。在养禽业，由于超强毒株的出现，使得活疫苗的应用受到很多人关注，要求寻找替代疫苗。然而，灭活疫苗或重组亚单位疫苗不能提供足够的保护，通常需要使用佐剂。但是油佐剂通常会诱导局部负反应，导致肉品质降低，因此在家禽上没有合适的、价廉的、高效的佐剂与抗原一起免疫鸡体。在过去的几年中，应用细胞因子、趋化因子以及共刺激分子作为DNA疫苗的分子佐剂的研究报告很多。IL-2、IL-12或 IL-18与人前列腺肿瘤疫苗合用，能使小鼠显著增强Th细胞增殖(Kim et al,2000)。将IL-18和IL-12基因融合入树突状细胞(DC)，免疫小鼠能提高IFN-γ的表达(Iinuma et al,2006)。原核表达重组鸡白细胞介素-2与鸡新城疫-禽流感-法氏囊-传支四联油乳剂灭活苗同时使用明显提高抗体效价，且无毒副作用(费聿锋等,2004;Henke et al,2006)。
细胞因子(Henke et al,2006;Ma et al,2006)质粒DNA注射后在体内相当长的时间内都会表达细胞因子，因此当细胞因子被应用于调节DNA疫苗的免疫应答时，就具有非常明显的优势。诱导Thl型应答的细胞因子与DNA疫苗结合起来，大多数的研究结果发现：IgG 1/ IgG2a的比率随着同时注射IFN-γ、IL- 2、IL-12、IL-15或IL-18编码质粒而下降，大多数的DTH应答和CTL应答也增强。DNA疫苗与编码诱导Th2型应答的细胞因子的质粒一起注射，诱导的免疫应答通常以产生高水平的IgG 1抗体为特征，导致高水平的总抗体和高IgG 1/ IgG2a抗体比率。IL-18 cDNA疫苗对小鼠自发性狼疮样病有一定效果(Bossu et al,2003)。将前列腺抗原特异性抗原PSA的DNA与鼠IL-18质粒共同免疫小鼠，使极低剂量的抗原也能获得很好的保护率(Marshall et al,2006)。将IL-12、IL-18基因与猪瘟病毒糖蛋白gp55/E2构建共表达质粒，肌肉注射3次，IL-18组能提高攻毒保护率(Wienhold et al,2005)。将AIV的HA基因与鸡IL-18基因插入痘病毒构建重组痘病毒，免疫SPF鸡和商品来航鸡，有100%的保护率(Ma et al,2006)。以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应(江文正等,2004)。
用His标签融合表达的鸡IL-18重组蛋白与NDV疫苗联合使用，检测抗体，IL-18作为佐剂的效果优于氢氧化铝(Degen et al,2005)。将表达pcDNA3l /ChIL-18DNA疫苗和新城疫灭活苗联合注射鸡体，结果显示用常规ND灭活疫苗与ChIL-18基因重组真核表达质粒联合注射，比只用常规ND灭活苗免疫鸡其T淋巴细胞转化功能有明显提高，单独应用ChIL-18基因重组真核表达质粒注射的鸡其T淋巴细胞转化功能也比不注射pChIL-18的明显增强(温纳相等,2005)。曹素芳等将共表达pcDNA3l/oomph-ChIL-18 DNA疫苗免疫鸡，其保护效率达到8/17，而pcDNA3l/ompH DNA疫苗和重组蛋白ompmH油乳苗保护率分别为5/17和2/17，很明显鸡IL-18能提高基因疫苗的免疫效果。由于基因疫苗的研究还处于起步阶段，尚有许多问题未能解决，远未达到在临床应用的阶段。
二、鸡IL-18的研究进展
（一）鸡IL-18的发现
2000年，Schneider等根据鸡法氏囊EST(Expressed Sequence Tag)数据库中相应的基因序列分析，设计特异性引物，从脂多糖(LPS)刺激的鸡巨噬细胞系HD-11的cDNA中首次扩增并克隆出来鸡IL-18(Chicken Interleukin-18,ChIL-18)。序列分析表明，在第29位天门冬氨酸残基处由IL-1β转换酶切割除去前导序列而成为成熟的鸡IL-18多肽，其成熟蛋白由169个氨基酸组成。将编码ChIL-18成熟蛋白的基因克隆至原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达，获得相对分子质量约为23kDa的重组融合蛋白(His-ChIL-18)。ChIL-18与哺乳动物的IL-18在氨基酸水平上约有30%的同源性。还证明，rChIL-18具有刺激鸡脾细胞产生ChIFN-γ的生物学活性，至于ChIL-18的其他生物功能还有待于进一步研究(Schneider et al,2000)。
（二）鸡IL-18的研究
2003年，刘胜旺等报道将编码鸡IL-18成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，表达的融合蛋白占菌体蛋白的30%，分子量约为23kDa。刘胜旺等用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验对多克隆抗血清进行了证明。2005年，胡敬东等通过引物设计去除ChIL-18的前导序列，直接克隆了ChIL-18成熟蛋白基因，并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，经测序鉴定正确后在大肠杆菌BL21中进行表达。结果表明，该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST-ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32%，为进一步研究有关重组ChIL-18的生物学特性及其临床应用打下了基础。利用白介素-18等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫(Degen et al,2005)，不仅能有效防控畜禽疾病，而且将在畜牧业生产中产生巨大的经济效益，是被普遍看好并具有广阔应用前景的新型佐剂(王宪文等,2008)。随着分子生物学、免疫学理论和技术的迅猛发展，学者们对白介素-18等细胞因子进行了越来越多的研究(窦永喜等,2005)，在畜禽疾病的治疗和预防上显示了广阔的前景。
（三）原核表达产物的纯化方法
大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。包涵体易于分离纯化,只要能够在体外成功复性,将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。然而,重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成坚硬的、不溶的、无活性的聚集体(aggregation)、又称包涵体（inclusion body），必须经过变性、复性才能获得生物学功能。
大肠杆菌表达系统中,两方面因素可造成包涵体形成：其一,为追求较高的表达效率,在载体系统中采用强的启动子和增强子序列，靶蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的15%～50%和40%～50%（Makrides,1996）。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系,都可形成包涵体（Gribskov et al,1983）。其二,大肠杆菌细菌细胞没有与真核细胞完全适应的结构基础和折叠机制,缺乏辅助真核蛋白质折叠的分子伴侣和折叠酶。而且，对于含有二硫键的重组蛋白而言，处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键蛋白质的氧化折叠。硫氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌株ADA494,ADA494( DE3)等有利于二硫键在细胞质内的形成（宁云山等，2001）。当蛋白存在一个以上二硫键时,可以出现多种不同组合的构象，而其中只有一种是天然构象,生物学活性最高。组合数目随着蛋白二硫键数目的增加，而呈几何级数增长,因此,必须建立一个环境使二硫键错配能得到有效的纠正。
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