第一章文献综述
苹果(Malus x domestica Borkh)是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232万hm2 和4 300万t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。
病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple）和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病（Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3 d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种‘金冠’‘嘎拉’品种极易感病，尤其是‘金冠’ 在世界苹果生产国中（中国除外）品种比例最高，这也是选择‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本（陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对‘金冠’‘嘎拉’等品种的侵害，而可能是对‘金冠’系、‘嘎拉’系苹果的为害。
化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少3 000株(陈学森，2010)，加上果树具有童期长（6～12年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。
因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。
第一节苹果炭疽菌叶枯病的发生与为害
苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值（刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的‘嘎拉’苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate（Leite et al,1988；Camilo & Denardi，2002；González et al，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病（Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。
1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害(Katsurayama et al，2000；Crusius et al，2002；Velho et al，2014)。1998年在美国田纳西州的两个‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害(González，1999，2003)。我国最早于2008年发现了炭疽菌叶枯病（王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起‘嘎拉’‘金冠’等苹果的大量落叶。尤为严重的是在2011年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的‘嘎拉’‘金冠’等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花(宋清等，2012)(附图1-1)。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳Gcingulata(宋清等，2012;Wang et al，2012)。González等（2006）通过利用 mtDNA-RFLP对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起GLS的病原分别属于尖孢炭疽菌Cacutatum 和围小丛壳Gcingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群（王嶶等，2015）。王薇等（2015）的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）和隐秘刺盘孢（Caenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。
一、苹果炭疽菌叶枯病的为害症状
由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为（附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3 d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点(分生孢子盘)，呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物（宋清等，2012；符丹丹，2014）。
二、苹果炭疽菌叶枯病的病原
苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为Glomerella cingulata(Stonem）Spauld & Schrenk，属真菌子囊菌(亚)门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz）Penz& Sacc和尖孢炭疽菌Cacutatum JHSimmonds（González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色(符丹丹，2014)。
三、苹果炭疽菌叶枯病的侵染规律
在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一（宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。
Wang等(2015)的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。
第二节植物与病原微生物互作的机制
植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al，2009；Boller et al，2009）。
一、植物对病原微生物侵染的基础抗性(PTI)
研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs)(Jones and Dangl，2006)，例如细菌的鞭毛蛋白(flagellin)。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中(Zipfel et al，2008)，所以它们也被称之为微生物相关分子模式(Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs)。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子(EF-Tu)及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等(Van et al，2008；Naito et al，2008)。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)。PRRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白(LRR-RLP)(Fritz-Laylin et al，2005)。例如，鞭毛蛋白的识别受体FLS2(Gomez-Gomez，et al，2000；Chinchilla，et al，2006)、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP(Kaku et al，2006)、延伸因子的识别受体EFR（EF-Tu receptor）(Zipfel et al，2006)、水稻Ax21 的识别受体XA21(Park et al，2010)、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl(Miya et al，2007；Wan et al，2008)、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1(Chen et al，2010)等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应（Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs 并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性(Basal Disease Resistance)，也称为基础免疫(Basal Immunity)（Boller et al，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫(PAMP-triggered Immunity，PTI)，可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等(Navarro et al,2008)，从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵(赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012)。
在PTI中，研究最为清楚的PAMPs 及其相应PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体FLS2(Flagellin-sensing 2)。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段(flg22)，含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守（Felix et al,1999）。Chinchilla等（2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK）FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能（程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pvOryzae)的病原相关分子模式（PAMP）是N末端具有一个硫酸化肽段（axYS22）的蛋白Ax21，由17个氨基酸组成。axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白（Lee et al，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白(Chitin elicitor binding protein，CEBiP)和拟南芥的受体激酶(LysM-containing chitin elicitor receptor kinase，CERKl)是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP介导的免疫反应需要其他受体的参与（Kaku et al，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质(Lizasa et al，2010)。
二、病原微生物对PTI的抑制
植物通过PRRs识别外来病原微生物的PAMPs触发PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对PTI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏(Badel et al，2002)，一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用（Schulze-Lefert et al，2003），一部分效应子则有可能对PTI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。
在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统(Type III secretion system，TTSS)。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及AvrPtoB能够成功的抑制PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明，AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性（Xiang et al，2008），并干扰了FLS2-BAK1复合体的形成(Shan et al，2008)。AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关(Gohre et al，2008)。丁香假单胞菌的另一个效应子HopAI1是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能（Zhang et al，2007）。
三、植物对病原微生物的基因对基因抗性(ETI)
病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的PTI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI)（Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因(Resistance gene，R gene)所编码的NB-LRR(Nucleotide binding-leucine rich repeat)蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应（hypersensitive response，HR）。
植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成(Elmore et al，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将NB-LRR蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导（Collier et al，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的RIN4蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子(AvrRpt2、AvrRpm1、AvrB及HopF2)的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。AvrRpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI（Axtell et al，2003）。直接识别是NB-LRR蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）的效应子 Pop2 直接结合，从而启动了ETI 应答（Deslandes et al，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的TIR-NB-LRR蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI 应答（Dodds et al，2006）。
植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被Jones等（2006）总结为“之”字形模型（附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 PTI。植物通过PRRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。
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