孙新城：郑州轻工业大学，医学博士，副教授，硕士生导师。主要从事食源性微生物检测与防控相关研究。现为河南省生物工程学会常务理事，中国食源性微生物检测技术创新战略联盟常务理事，河南省农村生活垃圾和污水处理专家，食品生产与安全河南省协同创新中心办公室主任。2017.02-2018.06美国农业部西部研究中心访问学者。主持和参与完成国家自然科学基金，河南省科技成果转化项目、河南省重点攻关项目、河南省重点研发项目等项目7项，获河南省科技进步奖3项，授权专利1项，参与申报并取得国家新药证书及生产批文新产品10个；公开发表论文40余篇，SCI收录12骗。参与编写教材著作6部。魏涛：男，汉族，河南焦作人，博士，郑州轻工业大学教授，硕士生导师。河南省高校科技创新人才，河南省教育厅学术技术带头人，河南省教学标兵，河南省优秀硕士论文指导教师。长期从事微生物资源开发与食品酶催化转化研究，主持和参与等科研项目10多项，获得省部级等科技奖励8项，发表国内外学术论文40多篇，授权国家发明专利4项。

食源性病原微生物是导致食源性疾病的主要因素，主要包括致病菌、病毒、真菌、寄生虫等。做好食源性病原微生物的检测、控制和处理工作，是人民群众身体健康和生命安全的重要保障，也是国民经济健康运行的重要基础。本书在概述食源性病原微生物及其危害的基础上，对食源性致病菌PCR检测方法、食源性病毒检测方法、食源性真菌检测方法、食源性寄生虫检测方法、免疫技术等主要的食源性病原微生物快速检测方法进行了深入研究，并就重组pfuDNA聚合酶、嗜热古菌Sulfolobustokodaii­新型核酸酶NurA、硫化叶菌Sulfolobustokodaii解旋酶HerA等工具酶的开发技术创新进行了探究。全书理论严谨、注重创新、兼顾应用，既具有较高的理论价值，又具有较强的实用性，可供生物工程专业的本科生以及食品、医药等行业的工程技术人员参考使用。

1食源性病原微生物及其检测方法

概述

食源性病原微生物是通过被污染食品而引发人类疾病的一类微生物，长期以来，食品安全的一项重要工作就是与这类病原菌作斗争。由于广泛使用抗生素和病原微生物的自然变异等诸多因素，许多老的病原微生物在基因水平上发生了变化，对人类的致病性越来越强，给人类健康带来新的挑战；同时科学家不断改进检测技术，特别是近年来随着分子生物学技术和建立在免疫学基础上的血清学技术的发展，涌现出许多新的快速准确鉴别食源性病原微生物的方法。

11食源性病原微生物的概念界定及其危害

人们日常生活中，食源性病原微生物对人们的饮食健康带来巨大危害，下面对食源性病原微生物的概念进行简单概述，并对常见的食源性病毒引发的疾病展开讨论。

111概述

无论是在发达国家还是在发展中国家，食源性疾病已成为最主要的公共卫生问题之一。国际权威组织及各国对食源性疾病都有明确的定义。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将食源性疾病定义为由于摄入食物中所含致病因子而引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。国际奶品、食品与环境卫生工作者协会(International Association of Milk，Food and Environmental Sanitarians，IAMFES)认为食源性疾病是指因摄入食品引起的各种综合征。美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)将食源性疾病定义为食用了受污染的食品或者饮料而引起的疾病。在我国《食物中毒诊断标准及技术处理总则》（GB 14938—1994）中将其定义为因摄入含有生物性、化学性有毒有害物质的食品后出现的非传染性的急性、亚急性疾病。由此可见，食源性疾病即是以食物为载体或媒介，通过食品引发或传播的疾病。根据食品中有毒有害成分的特征分析，区分为生物性、化学性和物理性危害，病原微生物是生物性危害主要因素。近年来，由食源性病原微生物引发的沙门氏菌病、霍乱、肠出血性大肠杆菌感染、甲型肝炎等食源性疾病在发达国家和发展中国家不断暴发流行，流行病学监测数据表明食源性病原微生物引发的食源性疾病的发病率持续上升，国际相关组织及各国政府已充分认识到食源性病原微生物对食品安全的影响，并在全球范围采取多种方式加以严格控制。

112食源性病原微生物引发的疾病种类及其危害

世界卫生组织将食源性疾病分为五种类型：生物性食物中毒、细菌性肠道感染症、病毒性肠道感染症、食源性寄生虫病、人畜共患感染症。食源性病原微生物与这五种类型的食源性疾病均有关联。

1121食源性病原微生物引发的疾病种类

11211生物性食物中毒

生物性食物中毒是指摄入含有生物性致病因素的食物而发生的非传染性的急性、亚急性疾病。细菌、真菌及其毒素和动植物毒素引起的食物中毒统称为生物性食物中毒，是食物中毒中最多见的类型。生物性食物中毒不具有人传人的特性，其流行曲线多为点源暴发。

11212细菌性肠道感染症

肠道菌是食源性疾病中最常见和最主要的致病因素。食品被肠道致病菌严重污染时，可感染人类引起肠道感染症。由于许多细菌性肠道感染症可以人传人，故也被称作肠道传染病，肠道传染病常在一个潜伏期内出现多个流行高峰，如伤寒、霍乱、痢疾等。除此之外，有些病原菌同时还导致其他疾病产生，如李斯特氏菌会引起脑膜炎、败血症和孕妇流产或死胎等；出血性大肠埃希氏菌O157H7会引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征。

11213病毒性肠道感染症

在食源性微生物病原体中，除细菌和真菌毒素外，还有以食品为传播载体经粪—口途径感染人的病毒。目前发现的这类病毒有：轮状病毒、星状病毒、腺病毒、诺如病毒(Norovirus)、甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等；此外，乙型、丙型和丁型肝炎病毒虽主要经血液等非肠道途径传播，但也有经粪—口途径感染人的报道。由病毒引起的食源性疾病主要为病毒性胃肠炎和病毒性肝炎。世界范围内由食品引起的病毒性胃肠炎已逐渐成为一种更为严重的公共卫生问题。由于病原体检测技术要求较高，人类对病毒性腹泻的控制还比较难。此外，人类新型克雅病(CJD)引起了普遍关注，其感染和传播途径主要是通过摄入被疯牛病病原——朊毒蛋白污染的食物而引起。

11214食源性寄生虫病

摄入污染了寄生虫或其虫卵的食品而感染的寄生虫病称为食源性寄生虫病。近年来由于生食河鱼、蟹而感染寄生虫病的情况有增长趋势。寄生虫侵入人体后，在移行、发育、繁殖和寄生过程中，可对人体组织、器官造成3方面损害：一是夺取人摄入的营养物质；二是机械性损伤；三是毒素作用和免疫损伤，表现为营养不良、贫血、黏膜出血、发热、荨麻疹和局部组织炎症、坏死、增生等病征。

11215人畜共患感染症

人畜共患感染症是指在动物与人类之间传播的疾病。如家畜感染了李斯特氏菌、肠杆菌科细菌或患了炭疽、结核、布氏杆菌病后，人吃了病畜的肉或奶可致病；禽类感染了空肠弯曲菌和沙门氏菌后，人吃了病禽的肉或蛋，也可引起腹泻。

1122食源性病原微生物的危害分类

食源性病原微生物通常分为两大类：一类为感染型，如沙门氏菌、空肠弯曲菌、致病性大肠杆菌；另一类为毒素型，如蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌。感染型微生物可以在人类肠道中增殖；毒素型微生物则是产生芽孢或毒素，即使通过热杀菌也不能消除其危害。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)依据微生物致病力强弱(即危害程度)将食源性病原微生物分成4类，见表1-1-1。

表1-1-1国际食品微生物标准委员会对病原体的危害程度分类

危害程度病原体

Ⅰ级：病症温和、无生命危险、无后遗症、病程短、能自我恢复蜡样芽孢杆菌(包括呕吐毒素)，A型产气荚膜梭菌，诺如病毒，大肠杆菌(EPEC型、ETEC型)，金黄色葡萄球菌，非01型和0139型霍乱弧菌、副溶血弧菌

Ⅱ级：危害严重、致残但不危及生命、少有后遗症、病程中等空肠弯曲菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，志贺氏菌，甲型肝炎病毒，单核细胞增生李斯特氏菌，微小隐孢子虫，致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，卡晏环孢子虫

Ⅲ级：对大众有严重危害、有生命危险、慢性后遗症、病程长布鲁氏菌病，肉毒素，大肠杆菌(EHEC型)，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，结核杆菌，痢疾志贺氏菌，黄曲霉毒素，01型和0139型霍乱弧菌

Ⅳ级：对特殊人群有严重危害、有生命危险、慢性后遗症、病程长019(GBS)型空肠弯曲菌，C型产气荚膜梭菌，甲型肝炎病毒，微小隐孢子虫，创伤弧菌，单核细胞增生李斯特氏菌，大肠杆菌EPEC型(婴儿致死)，阪崎肠杆菌

12食源性疾病的产生机制及现状

食源性疾病每年有多少人发病？其人数目前非常难以精确统计，许多国家和地方卫生机构只是刚刚开始收集详细的食源性疾病数据并进行报告，即便如此，数据也是不可靠的，只有1％～5％的食源性疾病个案得到了报道，在绝大多数的事例中，人们并不寻求医疗帮助，或者因为症状是温和的，当症状消失之后就停止治疗。因此，在短期内，卫生机构不可能收集到完整的资料。

食品工业随着科技的发展而迅速发展起来，并且积累了丰富的经验，表现在食品加工工艺的改良、加工过程的质量控制、对有害生物的实时在线监控等方面，这些技术的应用大大减少了病原微生物对食品的污染机会。然而，随着贸易的增加、人类生活方式的改变、环境的变化等，特别是进入21世纪以后，生态环境进一步改变、食品加工深度工业化、贸易全球化、旅游便利化以及病原菌自身的变化如耐药菌株和变异病原体的出现，使得食源性病原微生物的传播呈现多环节、长距离发生的特点；虽然细菌生长时间和发病机制没有改变，但当今人类活动的速度和范围却是古代人类的100倍，这些因素使得食源性疾病的发病率不仅居高不下，而且还增加了大面积群发的危险性。

有缺陷的食品安全体系导致了较高的食品安全事件发生和疾病产生机会，其主要原因为沙门氏菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特氏菌这类致病微生物，农业用化学残留物质(杀虫剂、兽药)以及使用未批准的食品添加剂。每年由于食用不安全的食品和水，仅腹泻就导致180万儿童死亡。发展中国家食品生产系统面临着人口增长与城市化、饮食习惯的改变、食品和农产品工业产业化进程加快等一系列挑战，以及气候条件变化、卫生状况和公共基础设施落后的难题。许多发展中国家食品安全法往往不完善或已经过时，没有与国际接轨，负责食品安全与控制的责任部门分散，实验室缺少必备的设备。许多发达国家也有类似情况，如零散的食品安全体系经常不能覆盖源头上出现问题的初级产品，导致近年来禽源性产品中出现的新的沙门氏菌通过贸易形式向全球传播。

为确保对本国消费者的食品安全以及满足食品出口国在国际卫生和植物检疫方面的需求，国际食品安全机构应当更加警惕，生产者和贸易者应当在整个食物链过程中为食品的安全负起责任。

13常见的食源性致病菌

民以食为天，食以安为先。食品安全问题一直是关系国计民生的大问题，它威胁着人们的健康，而且还影响到我国食品的出口甚至关乎国家的形象。食品安全是维持社会稳定发展的基本保障，我们必须足够重视，决不可掉以轻心。而细菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒等微生物污染问题，是比较突出的食品安全问题。

食物由于食源性致病菌感染甚至超标的情况，屡见报道。2011年9—11月，美国科罗拉多州的香瓜由于受李斯特菌污染，造成李斯特菌疫情的暴发，该事件波及美国28个州，出现146例病例，其中30人死亡。根据我国卫生部发布的《全国食物中毒事件情况的通报》，2010—2014年，总共报道有895起食物中毒事件，其中微生物性污染引起的中毒事件占到总数的371％，中毒人数占总中毒人数的615％，分别为其他原因中毒事件之最。有研究统计，食源性疾病在发达国家漏报率为90%以上，而发展中国家的漏报率更高达95％以上。因此，食源性致病菌感染引起的食源性疾病的实际暴发形式可能更加严峻，建立快速检测食源性致病菌的方法迫在眉睫。

经研究发现，单核细胞增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157H7和假结核耶尔森氏菌等被公认为主要的食源性致病菌，可能会导致严重的传染性疾病。

131单核细胞增生性李斯特菌

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）呈短杆状，长为10～20μm，属革兰氏阳性菌，是常见的人畜共患病原菌，在自然界广泛分布。该菌属于需氧或兼性厌氧型，对理化因素抵抗力较强，对营养要求不高，普通培养基上生长良好，在pH值为4～96、温度3～45℃范围内的条件下均可生长。单增李斯特菌特有耐低温的性质，在5℃以下单增李斯特氏菌仍能进行生长繁殖，冷藏食品、低温即食食品广泛受其感染威胁。20世纪80年代以来，世界范围内单增李斯特氏菌病时有暴发，因此WHO将其列为四大食源性致病菌之一。

单增李斯特菌的致病物质主要有溶血素和细菌性过氧化物歧化酶。人畜在经口摄入该菌后，通常有呼吸困难、呕吐等症状出现，并且死亡率极高，会引起脑膜炎、败血症和孕妇的流产等，易感人群为孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人等免疫力低下者。由单增李斯特菌hly A基因编码的李斯特菌溶血素是其最主要的致病因子，单增李斯特菌hly A基因的缺失或突变，都会使其丧失致病性。

132大肠杆菌O157H7

大肠杆菌又称为大肠埃希氏菌，根据大肠杆菌体表抗原“O”和鞭毛抗原“H”，可将大肠杆菌鉴定出700多种血清型。其中大肠杆菌O157H7是大肠杆菌中造成人类疾病最多的，当然也存在其他致病性大肠杆菌，如大肠杆菌O121：H19等。

大肠杆菌O157H7为革兰氏阴性菌，两端钝圆呈短杆状，有鞭毛，无芽孢，需氧或兼性厌氧型。其最适生长温度为37℃，最适生长pH值为74，在75℃下1min即会死亡，但是在低温条件下可长期存活。大肠杆菌O157H7与普通大肠杆菌相比，大多数生化特征均相似，除了在48h内不能发酵或迟缓发酵山梨醇；其都有一个大小为60MDa的质粒，含有多处与致病性密切相关的功能蛋白编码的序列。

一般来说，菌量在100万以上的大肠杆菌才能致病，而大肠杆菌O157H7只需要10～100个细菌就可发病。动物体感染大肠杆菌O157H7后，该菌长期存在于体内，并且随粪便不断排出体外，对周围环境和食物造成污染。大肠杆菌O157H7主要引起出血性结肠炎，个别患者会发展成溶血性尿毒综合征、血栓形成性血小板减小性紫癜，此时死亡率高，危害十分严重。

133 沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）属于革兰氏阴性菌，肠杆菌科，大多数有鞭毛，无芽孢。在普通的营养琼脂培养基上即可生长良好，菌落特征与大肠杆菌相似，其最适生长温度为35～37℃，最适生长pH值为72～74。到2001年，世界范围内已经检测到2523种沙门氏菌的血清型，而我国已经发现有200多种。

经过研究发现，与沙门氏菌致病性相关的因子主要有侵袭基因inv编码的侵袭蛋白、肠毒素和内毒素。引起食物中毒的主要沙门氏菌血清型是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。进入肠道后迅速繁殖，经淋巴系统进入血液中，同时经免疫系统裂解时有内毒素释放，从而引起人类疾病，表现为急性胃肠炎、伤寒和败血症等。引起沙门氏菌食物中毒的食品多为肉、蛋、乳类及其相关制品等，摄食鸡和鸡产品是感染沙门氏菌的主要原因，这是因为沙门氏菌可以在鸡的脾脏和生殖系统中存活很长时间，进入蛋内部后又可抵抗蛋清中抗菌分子的侵袭。婴幼儿、老人以及免疫力低下者为易感人群。在美国，平均每年受沙门氏菌感染者多达100万人，其中17 000多人住院，600多人死亡。

134金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌简称金葡菌，是革兰氏阳性球菌，菌体常堆积成葡萄串状，需氧或兼性厌氧型，无芽孢和鞭毛，大多数无荚膜；其最适温度为37℃，最适生长pH值为74；营养要求不高，而且耐盐性显著；金黄色葡萄球菌有9种血清型，分别为A、B、C1、C2、C3、D、E、G和H 型，并且都能引起人体中毒，其中毒力最强的是A型。

金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中，是一种条件致病菌，在皮肤和动物鼻腔内是正常菌群，当其进入人体后，会产生大量肠毒素，致病性强，会引起皮肤软组织感染、败血症、脓毒症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎和中毒性休克综合征等，危害十分严重。在2000年，日本发生的“雪印牛奶中毒”事件，就是由于牛奶感染了金黄色葡萄球菌，危害人数达到14万人。

135志贺氏菌

志贺氏菌又称为痢疾杆菌，属于革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧型，可分为福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌这4个种群，无芽孢和鞭毛，多数有菌毛。

志贺氏菌通过人体的排泄系统直接传染，或者通过摄食被污染的食物和水间接传染，是人类细菌性痢疾最常见的致病菌，导致腹泻、痢疾等疾病，甚至出现急性坏死性结肠直肠炎，危及生命。在发展中国家，每年有大约1647亿人感染志贺氏菌，其中110万人因此死亡。据统计，在我国每年有大约200万人感染，发病率居感染类腹泻致病菌之首。

136假结核耶尔森氏菌

假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)是革兰氏阴性短杆菌，需氧或兼性厌氧型，属于耶尔森菌属，该菌属另有其他两种致病菌：小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。该菌对生长温度要求不高，0～45℃条件下均可生长，最适生长温度为22～30℃，37℃可失活。由于其耐低温的特性，冰箱贮存食物和低温即食食品是感染假结核耶尔森菌的重要传染源。

假结核耶尔森菌属于人兽共患病原菌，和小肠结肠炎耶尔森菌相比，其感染动物种类更广，但感染率低。假结核耶尔森菌在人群中主要以散发性感染为主，偶尔有不同规模的暴发，主要引起急性肾炎、肠系膜淋巴结炎和败血症性肺炎。

137肉毒梭菌

肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌，为革兰氏阳性的多形态大杆菌，芽孢位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，根据抗原性的不同，肉毒梭菌可分为A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G 8个类型。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的外毒素——肉毒毒素(botulinus toxin，BTX)或称肉毒神经毒素(botulinum neuroto xins，BoNTs)可引发食物中毒即肉毒中毒，能够引起人类中毒的主要别为A、B、E 3个类型。

肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界分布广泛，食物中肉毒梭菌主要来源于尘埃及粪便，尤其是带菌土壤。肉毒梭菌芽孢对热具有较强的抵抗力，在厌氧环境的食品中可发芽繁殖产生肉毒毒素，人类多因食入已产生毒素的食品而发生食物型肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌随蜂蜜等食物进入婴儿肠道内生长产毒引起的婴儿肉毒中毒也有存在。

肉毒中毒在世界各地时有发生，也是我国常见的食物中毒之一，肉毒中毒以冬春季为多，引起中毒的食品主要为肉类、各种鱼及肉制品，以及家庭自制植物性发酵食品。

1食源性病原微生物及其检测方法概述（）

11食源性病原微生物的概念界定及其危害（）

12食源性疾病的产生机制及现状（）

13常见的食源性致病菌（）

14常见的食源性病毒（）

2食源性致病菌阳性控品的制备（）

21常用菌种、试剂及仪器（）

22PCR技术及其应用（）

23食源性致病菌DNA的提取（）

24目的基因的选择及阳性模板的制备（）

3食源性致病菌PCR检测方法研究（）

31食源性致病菌常规PCR体系的优化确定（）

32食源性致病菌多重PCR检测方法研究（）

33食源性致病菌固相PCR检测方法研究（）

4食源性病毒检测方法研究（）

41食源性病毒常用检测方法（）

42甲型H1N1流感病毒及其检测方法（）

43基于固相PCR微孔板芯片的甲型H1N1流感病毒分型检验

方法研究（）

44基于Taqman探针的甲型H1N1流感病毒荧光定量PCR检测

方法研究（）

45甲型H1N1流感病毒M2e单克隆抗体的制备（）

5重组pfuDNA聚合酶的表达、纯化和理化性质研究（）

51pfuDNA聚合酶重组质粒的构建（）

52重组pfuDNA聚合酶的表达及纯化（）

53重组pfuDNA聚合酶的特性（）

6超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii新型核酸酶NurA的研究（）

61古菌及DNA的损伤与修复（）

62核酸酶及其在DNA修复中的作用机理（）

63超嗜热古菌Stokodaii核酸酶StoNurA纯化及生化性质分析（）

64StoNurA蛋白结构与功能的研究（）

65StoNurA与单链结合蛋白（single-strandedDNA-binding 

protein，SSB）相互作用的研究（）

7两种新型嗜热羟酸酯酶的克隆、表达及酶学性质研究（）

71嗜热酯酶EST10的克隆、表达纯化与酶学性质研究（）

72嗜热酯酶EstSt7的克隆、表达纯化和酶学性质研究（）

73结论与展望（）

参考文献（）