第1章 绪论
　　1.1 发酵工程基本内容和发展历史
　　生物技术是以生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他自然科学原理，按照预先的设计改造生物体，并利用微生物、动物或植物对原料进行加工，生产出人类所需产品或达到某种目的的技术。生物技术一般包括工业生物技术、农业生物技术、医药生物技术等。工业生物技术是指以微生物或酶为催化剂进行物质转化，大规模地生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等产品的生物技术。它是人类由化石（碳氢化合物）经济向生物（碳水化合物）经济过渡的必要工具，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。工业生物技术包括发酵工程、基因工程、细胞工程、酶工程和细胞工程。
　　发酵工程通常被认为是微生物在发酵罐中利用原料生产特定产物的技术。发酵工程是工业生物技术的最重要组成部分，并且正在重塑发酵工业和轻工业。
　　微生物是发酵工程技术的核心。这是因为微生物具有种类多、繁殖速度快、营养需求低、代谢能力强、代谢产物多等一系列优点，如微生物可以通过人工诱变和改造提供发酵性能；微生物所含有的酶种类多样，可以催化多种多样的生物化学反应；微生物能够利用廉价、易得的有机物和无机物等各种营养源，生产多种多样的产品；在工业规模设备中微生物生长和代谢的条件容易控制，从而使得发酵产品生产不受气候、季节等自然条件的限制。
　　发酵罐是微生物进行发酵过程的主要场所，包括种子培养和发酵。常见的机械搅拌式发酵罐系统至少包括空气提供部分（空气压缩机和过滤器）、搅拌部分（搅拌桨和电动机）、环境条件（如温度、pH、溶解氧、搅拌转速等）控制部分，以及培养基进入、发酵液排出等管路部分。
　　完整的发酵生产产品过程，在发酵结束后还必须采用各种分离提取技术从发酵液中获得特定产物。分离提取技术一般是不同化工单元的组合，如离心、过滤、膜分离、萃取、蒸馏、干燥，等等。图1.1是一幅典型的发酵工程主要内容示意图。
　　图1.1 发酵工程主要内容示意图
　　发酵工程技术的发展历史包括天然发酵阶段（1680年以前），然后是纯种培养发酵阶段（1680～1928年，以显微镜的发现作为分界），再进入深层发酵技术阶段（1928年后，青霉素的发现和大规模工业发酵），以及现代发酵工程技术阶段（1980年后，基因工程的出现和工业应用），并逐步发展至新一代发酵工程技术阶段（2000年后，合成生物学和信息技术的整合与应用）。
　　1.1.1 天然发酵阶段—以食品作为主要目标产品的发酵（1680年以前）
　　在尚未发现微生物的时代，人类已经开始利用自然接种的方法，发酵生产特定的制品，如各种酒类、醋、酸奶、面包等。有记载和考古发现的历史可以追溯到良渚文化时代（距今5300～4300年）、古埃及时代（距今约7400年）和贾湖遗址时代（距今9000～7500年）。近期对动物的研究甚至发现有些动物会有意识地贮存果实使其发酵。从远古时代到微生物被发现以前，食品生产一般多为家庭或作坊式的手工生产。天然发酵阶段的产品，主要特点包括：①多数发酵产品为厌氧培养；②微生物来源多为天然接种、非纯种培养；③多依靠经验；④产品质量不稳定。在人类科学地认识微生物之前，天然发酵不仅扩展了人类食物的种类，也在改善营养和保存食物等方面起到了非常重要的作用。此外，酒和醋的发展，对传统中药炮制方面也起到了十分重要的作用。
　　厌氧培养条件下可以实现较好生长的微生物，通常主要是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸菌等少数的食品微生物。这些微生物在生长过程中会积累乙醇、乳酸等物质，会在很大程度上抑制一些病原微生物和产毒素微生物的生长。但是，这也决定了早期的发酵主要是以酿酒酵母、乳酸菌等少数微生物为主的发酵模式，主要产品是各种酒精饮料、发酵乳制品等。厌氧培养也在很大程度上隔绝了发酵过程中其他微生物的污染。经过长时间的驯化，厌氧微生物可以得到很好的富集，从而形成优势微生物菌群。部分传统发酵食品过程中也涉及一些霉菌，霉菌在好氧条件下生长迅速，可以产生大量的酶，用于降解碳水化合物、脂肪、蛋白质等，显著促进食品的消化吸收，并且产生氨基酸等风味物质，也为酵母和细菌的生长提供更为丰富的底物。
　　早期由于发酵过程多来源于天然接种和非纯种培养，也会经常导致产品质量不稳定和一些食品安全问题。由于传统发酵过程的不确定性，基于长期的经验积累，人们也会利用蒸、煮等消毒措施，并且依据特定的节气来进行发酵工作。通常某个节气会有特定的温度、湿度和光照，对于发酵产品质量的稳定性确实会有很大帮助。此外，由于缺乏对微生物的认识，在酿造过程中通常还会伴随一些祭祀酒神等迷信活动，希望能够借此提升产品的质量和稳定性，这在白酒、黄酒、清酒等的酿造过程中持续了很长的时间，有些甚至作为文化现象延续至今。
　　1.1.2 纯种培养发酵阶段—从生活资料向生产资料的转变（1680～1928年）
　　1667年，荷兰科学家列文虎克（Antonie van Leeuwenhoek）利用显微镜发现了微生物，从此逐步揭开了微生物世界的秘密。此后，在1850～1880年期间，随着越来越多的微生物被人类发现，法国科学家巴斯德（Louis Pasteur）通过一系列的实验，逐步认识到发酵是由微生物的活动引起的。随着微生物学的不断发展，特别是无菌操作和微生物纯培养技术的逐步完善，人为控制微生物成为可能。为了实现微生物的纯培养，技术人员发明了简便的密闭式发酵罐等设备，有效减少了酸败等发酵失败现象，采用人工控制环境条件极大地提高了发酵的效率和稳定性。此后，厌氧发酵过程的发展，使得发酵工程技术从生活资料的生产，逐步向生产乙醇、丙酮、丁醇等生产资料转变。
　　微生物纯培养技术的建立，是发酵工程技术发展的**个转折标志。从19世纪末至今，在世界范围内利用微生物的分解代谢进行规模化工业生产，已有100多年的历史。纯培养技术的发展，使得人们可以更好地筛选获得具有更加优良性能的微生物，像培养动物和植物一样选择具有更好发酵性能的微生物。同时，纯培养技术也使得研究人员可以更加清晰地阐明单一微生物的代谢特性，即微生物最适合的培养条件是什么？微生物发酵积累目标产物的最适条件是什么？在此过程中，温度计、比重计和热交换器等设备被越来越多地用于发酵过程的控制中，极大地拓展了发酵工程的应用领域。
　　1.1.3 从厌氧发酵到好氧发酵—发酵工程目标产物的拓展（1929～1940年）
　　厌氧发酵在乙醇、丙酮、丁醇等的生产过程中取得了巨大的成功。然而，大部分已知的微生物是好氧微生物。好氧微生物生长更快，而且通常不会积累乳酸、乙醇、乙酸等产物，可以用于生产一些重要的微生物代谢产物。随着微生物纯培养技术的不断发展，研究人员已经在实验室发现微生物可以积累很多重要的目标产物。在很长一段时间内，微生物的好氧培养主要还是依赖培养皿和摇瓶，很难像厌氧发酵一样实现大规模的工业化生产。
　　1929年，英国细菌学家弗莱明（Alexander Fleming）在一次偶然的实验中发现了青霉素，并发现其可以有效杀死微生物，作为治疗细菌感染的药物。第二次世界大战的爆发，使得治疗感染的需求急剧增加。青霉素的发酵生产早期主要通过摇瓶进行，存在效价低、生产量小等问题。为了使青霉素大规模工业化发酵生产，研究人员在20世纪40年代创立了基于通气搅拌的好氧发酵工程技术，采用摇瓶通风培养以及空气纤维过滤的高效除菌技术。随着更多具有医学治疗用途的抗生素被发现，抗生素工业逐步兴起。
　　抗生素工业的兴起，使发酵工程技术应用被迅速拓展到医药工业。在此过程中发展的好氧培养技术，为利用更多的微生物发酵生产其他更多的发酵产品积累了丰富的理论和技术基础。此后，发酵工程从简单的厌氧分解代谢，更多地向复杂的合成代谢方向拓展，被用来生产今天我们所熟悉的各种有机酸、酶制剂、维生素、氨基酸、核苷酸等重要发酵产品。因此，基于通气搅拌的好氧发酵工程技术的建立，被认为是发酵工程技术发展的第二个转折标志。
　　1.1.4 从自然筛选到定向选择—发酵工程技术水平的不断提升（1940～1980年）
　　20世纪40～50年代，微生物学、生物化学、遗传学、分子生物学和基因工程等发酵工程支撑学科的迅速发展，使发酵微生物选育的科学性不断增强。人工诱变育种与代谢控制育种在20世纪50年代后发酵工程的迅速发展中起到了重要的支撑作用，促进了氨基酸、核苷酸发酵工业的建立。由于自然界中的微生物积累特定目标产物的含量大部分时候很低，需要几十倍甚至上百倍的提升，才有可能实现较为经济的发酵生产。
　　谷氨酸是一种重要的呈味物质，最早由德国科学家雷特豪于1846年在小麦面筋中首次分离获得。1908年日本的池田菊苗，从海带中分离获得谷氨酸，并发现谷氨酸的钠盐具有鲜味。1909年日本开始生产以谷氨酸一钠为主要成分的“味之素”，并上市出售。早期谷氨酸主要是将小麦面筋进行水解分离得到，成本和销售价格都非常高。在研究谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）过程中，科学家发现其可以利用廉价原料发酵生产谷氨酸。1956年，日本“味之素”实现了发酵法生产谷氨酸，并逐步提高了谷氨酸的发酵水平。此后，陆续实现了赖氨酸、苏氨酸等多种氨基酸的工业规模发酵生产。
　　氨基酸发酵工业的主要推动力在于人工诱变育种与代谢控制发酵技术。即首先将微生物进行人工诱变，再通过人工控制培养，选择性地大量生产人们所需要的物质。与此同时，单细胞蛋白、柠檬酸（citric acid，CA）等产品的生产，使人们积累了越来越多的经验，逐步发展出的pH、温度离线控制，以及分批补料和连续发酵等策略被越来越多地用于工业发酵过程。相关技术被成功用于多种核苷酸类物质、有机酸和抗生素的发酵生产中。可灭菌的pH和溶氧电极的出现，使得在线发酵过程优化与控制成为可能。发酵动力学、化工过程中单元操作的概念被广泛引入，使发酵工程的内涵不断深化，与传统发酵过程相比，科学性越来越强。因此，代谢控制发酵工程技术的创立，是发酵工程技术发展的第三个转折标志。
　　1.2 20世纪80年代后的发酵工程技术
　　20世纪80年代后，随着中国改革开放力度的不断加大，国内发酵工程产业也得到了发展。基因工程技术的出现和不断进步、材料技术的不断革新，给发酵工程技术的发展带来了全新的发展思路；发酵工程目标产物的不断扩展和发酵水平的不断提升，为越来越多的相关行业提供了更好的支撑。在这样的背景下，国内规模以上的发酵企业不断涌现，我国也逐步成长为发酵大国，多种发酵产品的发酵水平和年产量均在世界居于首位。
　　经过多年的发展，发酵工程已经可以明确地分为以下三部分：上游工程、中游工程和下游工程。①上游工程包括优良发酵菌株的选育和改造、发酵原料的预处理、最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定等；②中游工程主要指在最适发酵条件下，如何在发酵罐中大量培养细胞并积累目标产物的工艺技术，包括发酵开始前采用高温、高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行系统灭菌的技术，在发酵过程中向发酵罐中供给干燥无菌空气的空气过滤技术，在发酵过程中根据细胞生长和产物积累要求控制溶氧、pH、底物供给速度的计算机控制技术；③下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术，包括固液分离技术（离心分离、过滤分离、沉淀分离、膜分离等工艺）、细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶破壁等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等）、制剂化技术，以及最终产品的包装处理（真空干燥和冰冻干燥等）等。
　　1.2.1 菌种选育—从诱变筛选到代谢工程改造与优化
　　20世纪70年代开始，由于DNA体外重组技术的建立，发酵微生物的改造进入了一个崭新的阶段，这就是以基因工程技术为中心的生物工程时代。基因工程采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA导入受体细胞内，并进行繁殖和遗传。基于这些技术方法，