第一章绪论
仪器分析自 20世纪 30年代后期问世以来，已成为科学研究中不可或缺的角色，发挥着越来越重要的作用。随着社会科技的不断发展和相关技术的日新月异，仪器分析技术得到了很大程度的提高和发展，新仪器新方法不断涌现，为各个学科及交叉学科领域做出了巨大的贡献。科学研究的进步依靠高、精、尖实验仪器的发展，同时也促进了仪器的发展，对仪器分析技术提出了更高的要求。
生物科学的发展与生物仪器分析技术的进步密切相关，比如 X射线晶体衍射对 DNA双螺旋结构的发现起着至关重要的作用，而 DNA双螺旋结构的发现奠定了现代分子生物学研究的基石，使微观世界的大门为我们敞开，让我们得以一窥微观领域的奇妙景象。第一代测序技术的问世使人类得以完成人类基因组计划，第二、三代测序技术的出现不仅大大降低了测序成本，而且大幅提高了测序速度，保证了高准确性，为现代生物学的研究提供了强有力的技术支撑。诞生于 20世纪 80年代的生物质谱技术，为功能基因组学、蛋白质组学的研究奠定了基础。随着科学技术的发展，更精确、更快速、灵敏度更高的分析仪器以及新的技术和新的方法会不断涌现，这必将加速生物科学领域研究的不断发展。
第一节仪器分析概述
仪器分析是指采用比较特殊或者复杂的仪器设备，直接或间接地表征物质的各种特性（如物理、化学、生理性质等）及其变化，通过探头或传感器、分析转化器等转变成数据、图表、图片等来获取物质成分、含量、分布、结构等信息的分析方法。它基于各种学科的基本原理，采用电学、光学、精密仪器制造、计算机等先进技术来探知物质特性。仪器分析与化学分析是分析化学的两个相辅相成的分析方法。化学分析是分析化学的基础和原理，是常量分析，而仪器分析则灵敏度高、重复性好、样品用量少、自动化程度高、速度快，用来检测微量、痕量组分，是分析化学的主要发展方向。由于现代科学的发展，样品的复杂性、检测难度、需要得到的信息量等都在不断提高，因此，仪器的发展需要顺应科学研究的需求。
一、仪器分析的特点
与传统化学分析相比，仪器分析具有以下特点。①灵敏度高，检出限低。主要用于微量、痕量成分的分析，相对检出限一般在 10.8或 10.9数量级，有的可达到 10.12，如气相色谱法。②样品用量少。样品用量由化学分析的毫升、毫克级到微升、微克级，甚至更低，如，适于蛋白质组学研究的纳升液相色谱系统可到纳升级。③选择性高。化学分析中选择性*好的络合滴定依然有很多干扰，而仪器分析本身有较高的分辨率，可以通过检测条件和参数的调整使共存组分不产生干扰，还可以利用掩蔽和分离等技术大大提高其选择性。④分析速度快。仪器与计算机连接，分析过程自动化程度高，分析速度快、通量高、操作简单、重复性好。有的配备自动进样系统，自动检测系统，大大减少了实验时间和实验的人工误差，实现了短时间内对大量样品的数据分析。如，带有自动进样系统的色谱仪，设置好检测程序后可连续自动分析几十个样品。⑤用途广泛。传统的化学分析只能用于成分分析，而仪器分析除了提供成分信息，还能提供组分的价态、结构、空间分布等信息。⑥仪器和耗材成本高。一般仪器分析需要专业的、结构精细复杂的、价格昂贵的仪器设备，同时样品分析时所需的耗材成本也较高，尤其是生物仪器的样品检测，需要特定的、配套的、专一性的耗材。
二、仪器分析方法的分类
根据检测的物质性质，仪器分析方法一般可分为以下几种。
（一）电化学分析法
电化学分析法（ electrochemical analysis）是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础上，对组分进行定性和定量分析的仪器分析方法。主要包括电导分析法、电位分析法、电解分析法、伏安分析法和极谱分析法等。
（二）光学分析法
光学分析法（ optical analysis）是根据物质发射的电磁辐射以及物质与电磁辐射的相互作用来进行分析的一类重要的仪器分析方法，这些电磁辐射包括从 γ射线到无线电波的所有电磁波谱范围，可分为非光谱法和光谱法。
1.非光谱法
2.光谱法
物质与辐射能作用时，检测的是辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射、偏振等变化。如显微分析法、 X射线衍射法和 X射线小角散射法等。
物质与辐射能作用时，检测的是由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或者散射辐射的波长和强度变化。光谱法又分为原子光谱法和分子光谱法。①原子光谱法是由原子外层或者内层电子能级的变化所产生，原子的电子运动状态发生变化时，发射或吸收的有特定频率的电磁频谱，是线状光谱。其包括原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法和 X射线荧光光谱法等。②分子光谱法是由分子中电子能级、振动转动能级的跃迁产生，是带状光谱。其包含紫外可见吸收光谱法、红外光谱法、分子荧光光谱法、拉曼光谱法和圆二色光谱法等。
（三）色谱分析法
色谱分析法（ chromatographic analysis）是根据混合物中各组分在固定相和流动相中溶解、解析、吸附、脱附或其他亲和作用性能的微小差异，进行的一种物理或物理化学分离分析方法。当两相做相对运动时，各组分随着移动在两相中反复受到上述各种作用而得到分离。色谱分析法包括薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法和毛细管电泳技术等。
（四）其他分析法
除上述 3种分析方法外，还有利用热学、力学、声学、动力学等性质进行测定的仪器分析方法。主要包括以下 3种。
1.质谱分析法（mass spectrometry）
是指用电场和磁场将运动的离子，如带电荷的原子、分子或分子碎片等按它们的质荷比分离后进行定性、定量和结构分析的方法。有电子轰击质谱、场解吸附质谱、电子喷雾质谱、快原子轰击质谱和基质辅助激光解吸飞行时间质谱等。
2.热分析法（thermal analysis）
是指用热力学参数或物理参数随温度变化的关系进行分析的方法。有差示热分析、热重量法、导数热重量法、差示扫描量热法、热机械分析和动态热机械分析等。
3.放射性分析法（ radioactivation analysis）
是根据样品的辐射特征进行分析的方法。有同位素分析法和中子活化分析法等。
第二节现代生物仪器分析
高灵敏度、自动化的现代生物仪器分析技术大大地推动了生物科学基础研究和应用研究的发展。同时，生物科学的快速发展也需要新型生物仪器分析技术的升级和推广应用。一般来说，生物分子的结构分析有 “四大谱”和“三大法”。“四大谱”包括紫外 -可见吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振波谱和质谱； “三大法”包括晶体 X射线衍射分析、核磁共振波谱分析和冷冻电镜。此外，用于细胞和组织功能分析的生物仪器，如流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、高内涵细胞成像分析系统、活细胞工作站等。这些仪器分析技术使得生物科学的发展从量变走向质变，人们对生命体的认识也从宏观深入到细胞和分子水平，极大地推动了核酸、蛋白质和糖类等生物大分子的形态结构、功能特点以及调控机制等的研究。
一、现代生物仪器分析的现状
（一）分离技术
复杂样品的分离纯化为特定物质的特性研究奠定了基础。利用离心力可以分离和纯化某种生物大分子物质和细胞及其亚细胞组分。自 20世纪 20年代后期 Svedberg发明了第一台分析型超速离心机以来，随着离心技术的进步和离心设备的不断完善，以及高速和超速冷冻离心机的相继问世，离心（ centrifugation）分离技术已成为生命科学研究中一项*基本的技术。另外，由于带电粒子在电场中可以向与所带电荷相反的电极移动， 1937年，瑞典科学家 Tiselius设计了世界上第一台自由电泳仪，并成功地分离了血清中蛋白质的主要成分。随后，电泳（electrophoresis）分离技术得到了飞快地发展，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、核酸、其他有机化合物甚至无机离子等的分离。此外， 1906年，俄国植物学家茨维特将植物叶子色素溶液通过装填有吸附剂的柱子后发现，各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开形成不同的色带。利用待分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数、吸附能力等的不同来实现复杂样品的分离，即色谱技术（ chromatography）。这些分离技术目前已广泛应用于各实验室，极大地推动了生物科学领域的研究。
（二）显微观察技术
显微镜（ microscope）的出现使人们对微观世界的观察成为可能。随着各种标记技术和高精度显微镜的发展，荧光显微镜技术（ fluorescence microscopy）和激光共聚焦扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy）也相继问世，使其成为现代生物科学研究中一种必不可少的技术手段。在细胞及分子生物学、免疫学、遗传学、形态学、药理学、环境科学等领域具有不可替代的作用。另外，在普通光学显微镜的基础上设计发明的透射电子显微镜技术（transmission electron microscopy），其分辨率和放大倍数比光学显微镜提高了 1000倍。此外， 20世纪 60年代发展起来的扫描电子显微镜技术（ scanning electron microscopy），通过扫描固体样品的表面形态，得出有关样品的立体结构，以其高分辨率和科学的直观性显示出无比强大的魅力，是人类认识微观世界重要的工具。
（三）质谱分析技术
以气相色谱 -质谱联用技术（ gas chromatography-mass spectrometry）、液相色谱 -质谱（liquid chromatography-mass spectrometry）联用技术以及基质辅助激光解吸电离源质谱技术为代表的有机质谱技术在生物学领域也得到了广泛应用。以多组学技术为研究策略的一种系统生物学研究内容掀起了学术界的热潮，质谱技术以其快速、高灵敏度和高精确度的特点，广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和糖组学等多组学研究中，逐渐成为组学研究的核心技术。通过质谱数据的高通量筛选，为蛋白质、氨基酸和小分子代谢物等的定性、定量研究提供了快速的检测方法。作为系统生物学的基础研究手段，代谢组学主要通过质谱分析手段对生物系统基质中的小分子代谢物进行分析，*终回归到生物体的蛋白表达和基因组层面对其生物学功能进行验证。
（四）核磁共振波谱技术
核磁共振波谱技术（ nuclear magnetic resonance spectroscopy）可以研究物质的分子结构及物理特性。自 1946年发现了宏观物质的核磁共振现象后，随着超导核磁共振波谱技术和二维核磁共振波谱技术的发展，核磁共振波谱技术在生物学研究领域得到了广泛的应用。其研究对象几乎涵盖了生物体的所有组分，如蛋白质、氨基酸、核糖体、其他各种代谢产物等。高磁场强度和超低温探头的使用，使得核磁共振波谱仪的分辨率有了很大的提升，为代谢组学和结构生物学等的研究提供了有力的支撑。 20世纪 80年代以来，由于遗传工程和基因工程技术的迅速发展，使得蛋白质能够在体外大量表达，解决了蛋白质样品制备的问题，大大地推动了核磁鉴定蛋白结构功能的快速发展。另外，电子顺磁共振波谱技术（ electron paramagnetic resonance spectroscopy）是研究自由电子与外环境相互作用的有力工具之一，是检测自由基*直接的手段。它可以检测样品中未成对电子，得到有意义的结构和动态信息，在生物、材料科学、医药科学等领域可作为其他方法的补充，特别是在生物学中的应用，已经成为目前研究细胞膜结构的有效方法。
（五）光谱分析技术
光谱技术可以分析物质的成分、结构、理化性质，有紫外 -可见光谱技术、红外光谱技术、
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