第一章 基本型实验
第一节 细胞的形态、结构观察及组成显示
细胞的形态、结构及组成是细胞的基本特性,也是细胞研究的基础和必要工作.
要对细胞进行观察,必须先制备细胞标本片.依制片方法及特点不同,制备的细胞标本片有:装片、涂片、压片、印片、爬片、铺片、磨片、徒手切片、冰冻切片、石蜡切片、超薄切片等.其中,装片、涂片和徒手切片是最常用的制片.
由于细胞的大小 (1~30μm)超出人肉眼的分辨率 (100μm),对细胞形态及结构的观察需要借助于各种显微镜.普通光学显微镜 (光镜 )可观察超过0.2μm大小的结构,电子显微镜 (电镜)可观察小于0.2μm但大于0.1nm的结构.有自发荧光或荧光染色的结构还可借助荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察.
可利用已知染色试剂及化学反应原位显示细胞化学组成,并利用显微镜进行定性、定位和定量研究.这种研究细胞的科学称为细胞化学 (ytceity),包括细
cohmsr
胞成分的普通染色和荧光染色、酶细胞化学、免疫细胞化学、电镜细胞化学等.
普通染色指用普通光学显微镜可以观察结果的对细胞结构及组分直接染色的技术.例如,用次甲基蓝染料染细胞核,甲基绿Ｇ吡咯红染 DNA和 RNA,JAnus gre
n (詹纳斯绿 B)染线粒体,中性红染液泡,碘染淀粉,油红 O染脂肪等.
荧光染色指用针对细胞器或细胞化学成分的特异荧光探针对细胞进行染色并
借助荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察结果的技术.如用 PI、DAPI、
Hoechst33342等染色.
酶细胞化学是用酶作用于底物,并在无或有其他试剂进一步反应后形成可视沉淀显示细胞内酶存在及活性的方法.免疫细胞化学 (y,ICC)是利用免疫学原理,用荧光
immunocytochemistr素、酶、金属、发光物质等可视系统标记抗体 (或抗原),然后通过特异的抗原Ｇ抗体反应原位显示细胞及组织抗原或半抗原成分的方法.根据标记物的不同,免疫细胞化学可分为免疫酶细胞化学技术、免疫荧光细胞化学技术、免疫金Ｇ银细胞化学技术、免疫胶体铁蛋白技术、亲和免疫细胞化学技术及免疫电子显微镜技术等 ,标记物分别为酶、荧光素、胶体金、胶体铁、亲和配体等 .其中的免疫酶细胞化学技术和免疫荧光细胞化学技术最为常用 .检测范围非常广 ,包括各种蛋白质、多肽、核酸、部分类脂、多糖等 .
电镜细胞化学是从光镜细胞化学的基础上发展起来的一种超微结构显示技术,是利用特定的化学显色反应 ,形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位 ,借助电子显微镜进行超微结构的原位分析 .其中包括免疫电镜技术、电镜酶细胞化学技术等 .
实验1 血细胞装片及涂片的制备及染色观察
装片法是一种最为简单、最为常用的生物组织及细胞玻片标本制备方法 .其是将微小的生物或从生物体上撕下、挑取少量的材料封装于载玻片与盖玻片之间制成的标本 .其基本上保持了细胞的原有形态及状态 .动物细胞悬液 ,藻类、菌类、蕨类的原叶体、孢子囊 ,纤细的苔藓植物 ,被子植物的表皮、花粉粒 ,幼小动物等都可用装片法制备标本 .
涂片法是指将细胞悬液均匀地涂布在载玻片上制备的细胞标本 ,可用于制备各种细胞悬液的可保存光学显微镜标本片 .培养的各种悬浮细胞及医学临床标本血液、骨髓、痰液、羊水、生殖道分泌物、胸腹腔渗出液等都可用涂片法制备标本 .
实验原理
适当稀释的绵羊抗凝血及大肠杆菌菌液 ,制成装片后细胞密度适宜 ,可在显微镜下观察其细胞形态 .
用推片法将血液制成薄的血涂片 ,可使血细胞成单层排列 .用含天青和伊红的复合染料如瑞氏染液进行染色时 ,细胞中的碱性物质如红细胞中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色 ;细胞质中的嗜碱性颗粒与碱性染料次甲基蓝结合染成蓝色 ;中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态,与伊红和美蓝均不能很好地结合 ,因此染成淡紫红色 .
实验材料、试剂及器材
1.材料
(1)小鼠血
:肝素抗凝 ,心脏采血 ,用0.9％氯化钠生理盐水稀释1000倍.
(2)大肠杆菌菌液
:大肠杆菌DH5α ,液体 LB培养基培养过夜 ,用0.9％
氯化钠生理盐水稀释20倍.
(3)新采集小鼠血 .采集时需加肝素钠溶液抗凝 .
2.试剂
(1)0.9％氯化钠生理盐水 .
(2)肝素钠溶液 :用生理盐水配成180IU /mL.
(3)瑞氏 (Wright.s)染液 :瑞氏染料粉末0.1 g和甲醇60mL .配法 :把染料放在研钵内 ,加少量甲醇研磨 ,使染料溶解 ,然后把溶解的染料倒入干净的棕色玻璃瓶 ,并至用完甲醇为止 .
(4)pH6.4的 PBS:磷酸二氢钾 (无水 )0.3 g,磷酸氢二钠 (无水 )0.2 g,先加800mL蒸馏水溶解 ,调 pH至6.4 ,再补加蒸馏水至1000mL .
3.仪器和用具
普通光学显微镜、载玻片及盖玻片、酒精棉球、蜡笔、胶头吸管、1.5mL EP管、吸水纸、擦镜纸等 .
实验操作
(一)细胞装片的制备及观察技巧
.细胞装片的制备
1 取载玻片 ,用胶头滴管向其中央位置分别滴加1000倍稀释的羊血细胞悬液和20倍稀释的大肠杆菌菌液悬液 ,加盖玻片 ,制成装片 .对于初次观察的细胞样品 ,可滴加较多量 (1个自然滴 ,约50 μL)的细胞悬液 ,使标本较厚 ,在显微镜下调焦时可通过寻找流动的液体判断细胞层 ,确保所观察到的物体为细胞悬液中的细胞 ;当对细胞形态有了初步认识后 ,如要进一步观察细胞形态结构 ,可滴加适量 (以加盖玻片后细胞悬液恰好布满整个盖玻片下面为原则 )细胞悬液 .为了避免加盖玻片时产生气泡 ,可先让盖玻片一侧边缘接触液滴边缘 ,待液滴沿盖玻片边缘展开后 ,随液体扩散缓慢放下盖玻片 .
2.显微观察技巧
旋转物镜转换器到10×物镜 ,先将粗调焦螺旋外旋 ,使标本升至最高点 ,然后一边用眼睛通过目镜观察标本 ,一边逐渐向内旋转粗调焦螺旋 ,直至视野中出现晃动的液体 ,观测细胞即在其中 .如视野中细胞太小 ,转换物镜至40×高倍镜 ,一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像 .
(二)血细胞涂片的制备、染色及观察
1.清洁载玻片
使用前 ,必须仔细清洗 ,并用软布或脱脂棉蘸取70％乙醇清洁 .目的是便
于制片均匀 ;避免酸碱物质对染色的影响 .
2.加样
用胶头滴管加1小滴 (约10 μL)细胞样品于载玻片长轴一端离边缘约1cm处中央 .
3.推片
将有样品的载玻片 A放在实验台等平坦地方 ,右手持另一张载玻片 B作为推片 ,用一侧短边边缘接触血滴前沿 ,待血滴沿载玻片 B边缘展开后 ,使载玻片 B以与载玻片 A呈30 °~45 °角向前匀速移动 ,将血液推成厚薄适宜的血涂片 .
4.干片
(1)空气干燥 :在空气中晃动血涂片 ,使其迅速干燥 .
(2)加热干燥 :握住涂片 ,在距离酒精灯火焰上方约5cm处晃动 ,加热干燥 .
5.选区
在显微镜下观察 ,选取细胞分散良好、分布均匀的血膜作为染色区域 ,用蜡笔画圈 (3cm×2 cm)作堤防 ,将欲染色区域围起来 ,防止染色时染料快速在载玻片上扩散而干掉 .
6.染色
用瑞氏染液染色 .方法 :先滴加适量瑞氏染液覆盖选定区域 ,等1m in;再滴加等量 pH6.4的 PBS稀释染液 ,轻轻旋转载玻片混匀 ,液面应浮现一层黄色金属样物质 ,然后静置染色15 ~20m in.
7.洗去多余染液
不要倒掉染液 ,直接用流水或滴加蒸馏水洗去浮液 ,自然晾干或用吸水纸吸干 .
8.封片
如要保存留用 ,可滴树胶加盖片封固 .
9.显微观察结果
1)装片标本
视野中主要为小鼠红细胞 ,呈圆形 ,胞质均匀 ;另外 ,可以看到表面呈毛刺样的粒细胞、较大且胞质中有颗粒的单核细胞等 ;大肠杆菌为长短不一的杆状细胞 .
2)小鼠血细胞涂片标本
红细胞 圆饼状无核 ,中间薄 ,周围厚 ;数量最多 ,布满整个视野 .
淋巴细胞 基本圆形 ,比红细胞稍大 .核深染且几乎占据整个细胞 ,一侧常有小凹陷 ;胞质色淡 ,很少 ,仅在细胞核外有一薄圈 .数量为白细胞中最多 ,通常超过70％ .
单核细胞 最大 ,少;胞体圆形或椭圆形 ;核常偏位 ,形态多样 (卵圆形、肾形、马蹄形等 );胞核着色比淋巴细胞核浅 ;核质比小于淋巴细胞 .数量通常不到白细胞总数的1％ .
中性粒细胞 形态不规则 ,外周常有突起 ;核腊肠状或分叶状 (2~5叶),胞质颗粒细小 ,染色浅 .数量在白细胞中仅次于淋巴细胞 ,通常超过白细胞总数的20％ .
嗜酸性粒细胞 胞体圆形 ,直径为10 ~15 μm,胞核常为2叶,胞质充满粗大的红色颗粒 .数量占白细胞总数的2％左右 ,随品种与鼠龄不同有较大变化 .
嗜碱性粒细胞 细胞呈球形 ,直径10 ~12 μm;胞核不规则 ,分叶或呈 S形,着色较浅 ;胞质内有大量深染的嗜碱性颗粒 ,有时将核覆盖 .数量极少 ,很难找到 .
血小板 最小 (2~4μm),多角形 ,聚集成群 .
注意问题
1.涂片用血量需适宜 ,太多容易导致标本过厚、细胞重叠 ,不便观察 ,也会因干燥过慢、缓慢失水造成细胞皱缩变形 ;太少容易导致血膜太薄、细胞太稀,不便观察 .
2.血涂片需干透后再进行染色 ,否则细胞在染色过程中容易脱落 .
3.用蜡笔作堤防时画的圈要完整 ,以免染料从缺口处流失 .
4.冲洗时不能先倒掉染液 ,以防染料沉着在血涂片上 ;冲洗时间不能过久 ,以防脱色 .如血涂片上有染料颗粒沉积 ,可滴加甲醇 ,然后立即用流水冲洗 ;如染色不够 ,可补染 ,染色时先加 PBS后加瑞氏染液 .
5.注意染液及冲洗液的 pH.瑞氏染色适宜 pH为6.4 ~6.8 ,染液偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常 ,不好辨认 .
作业与思考题
1.根据观察结果 ,画图显示小鼠各种血细胞 .2.若制备细胞涂片的细胞悬液样品浓度过小 ,制片前需要作何预处理 ?
拓展实验
分别用等量1mo l/L HCl和1mo l/L NAOH溶液与 pH6.4的 PBS混合后再稀释瑞氏染液染色血细胞涂片 ,观察染色环境偏酸和偏碱对于染色效果的影响 .
实验2 植物细胞的叶绿体、线粒体及液泡观察
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒的一种染色方法.意义是:便于观察活细胞内相关结构的变化.具体染色方法有:体内活染和体外活染 (超活染色).体内活染动物细胞时,常用注射法将染料注入动物体内;体内活染植物细胞时,可将染液加在培养基中.常用染料有:詹纳斯绿 B (JAnus gre
n)、中性红 (neutrAlred)、亮焦油紫、次甲基蓝、尼罗蓝 (Nileblue)等.詹纳斯绿 B和亮焦油紫都可用于线粒体染色,前者主要用于体外活染,后者可用于体内活染.中性红用于染液泡系,包括动物细胞的吞噬泡、食物泡、植物细胞的液泡等;中性红体内体外兼可用.次甲基蓝可用于染神经组织.尼罗蓝可染原生动物的大核.
实验原理
将撕取的植物叶下表皮制备成装片,可看到气孔及保卫细胞、副卫细胞、栅栏细胞等,栅栏细胞内的叶绿体较多而大,可不经染色而在普通光学显微镜下直接观察.细胞内的线粒体可被线粒体特异活体染料詹纳斯绿 B染色呈现蓝绿色,液泡可被液泡系特异活体染料中性红染色而呈红色.两种染料染色的原理是:中性红为弱碱性染料,专一在酸性的细胞器中积累,在中性或微碱性环境中,活细胞的液泡吸收中性红,进入液泡的中性红在酸性环境中解离出阳离子而呈现红色;詹纳斯绿 B可被线粒体的细胞色素氧化酶氧化成蓝绿色.
实验材料、试剂及器材
1.材料
青菜.
2.试剂
(1)0.04％中性红生理盐水溶液:先配成1％中性红水溶液,再用蒸馏水将1％中性红水溶液稀释成0.04％溶液,盛于棕色瓶中,暗处保存. (2)0.02％詹纳斯绿 B生理盐水液:先配成1％詹纳斯绿 B水溶液,再用0.9％氯化钠将1％詹纳斯绿 B水溶液稀释成0.02％溶液,盛于棕色瓶中,暗处保存.
3.仪器和用具
普通光学显微镜、单面刀片、圆头牙签、胶头吸管、载玻片与盖玻片等.
实验操作
(1)取5片载玻片,分别在其中3片中央滴加2滴蒸馏水、詹纳斯绿 B染液及中
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