第一篇骨转移瘤基础研究
第1章骨转移瘤发病的细胞生物学机制与细胞分子靶向治疗
约70%的乳腺癌或前列腺癌患者发生骨转移，30%～65%的晚期肺癌患者发生骨转移，晚期甲状腺癌和肾癌患者骨转移的概率分别为47%和30%。骨转移瘤提示疾病预后极其不良，可引起一系列骨相关事件（skeletal related event，SRE），包括骨骼疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓受压及其他神经受压症状。这不但降低了患者的生活质量，而且极大地加重了患者家庭的经济负担。据美国研究统计，临床上发生SRE患者治疗的平均费用为9480～13940美元，发生显著SRE患者治疗的平均医疗总费用为27982～48173美元。并且，骨转移瘤也预示着患者生存期短暂，根据不同文献报道患者中位生存期为6～12个月。因此，深入研究恶性肿瘤转移至骨骼的相关机制，以此来改善患者的治疗选择、提高患者的生活质量，以及延长患者的生存期显得必要而迫切。本章重点阐述骨转移瘤发病的细胞生物学机制和相应的细胞分子靶向治疗。
一、正常骨骼生物学
（一）骨微环境
骨骼主要由羟基磷灰石晶体矿化的Ⅰ型胶原构成。矿化的结构内含有大量的生长因子，包括转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor1，IGF-1）、血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）。骨质溶解可以释放这些生长因子进入骨微环境。正常骨微环境中的细胞包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、基质细胞和血管内皮细胞。破骨细胞介导骨质溶解，成骨细胞介导骨质形成。骨骼可以不断地以溶骨和成骨的方式进行动态重塑。骨微环境中有许多激素、细胞因子和其他相关分子，它们与骨微环境中的细胞存在着紧密的联系，并且在调节骨骼动态重塑平衡中起着主导作用。
（二）成骨细胞“双重”调节机制与OPG-RANKL-RANK系统
成骨细胞不但可以合成骨基质胶原前体以促进骨骼形成，而且对骨质矿化具有调节作用，即它既可以促进骨质矿化又可以促进溶骨，在骨骼重塑中起到“双重”调节作用。这主要是因为成骨细胞可以表达一些对骨质调节起重要作用的分子，包括核因子-κB（NF-κB）受体激活蛋白配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、甲状腺旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、前列腺素、雌激素和许多细胞因子。目前认识到其中*重要的脊柱转移瘤基础与临床是RANKL和OPG。RANKL有2种存在形式：跨膜结合蛋白和游离型多肽（跨膜结合型的胞外部分在140位或者145位氨基酸残基位点断裂而形成）。两种形式均可发挥作用，跨膜结合蛋白生物活性更强。在巨噬细胞集落刺激因子作用下，RANKL与单核细胞表面的核因子-κB受体激活蛋白（RANK）结合并促进多个单核细胞相互融合形成一个多核破骨细胞。RANK（肿瘤坏死因子受体家族成员）是一种跨膜结合蛋白，主要在成熟的破骨细胞及破骨细胞前体细胞表面表达。RANKL通过结合RANK介导破骨细胞形成、活化和生存。成骨细胞分泌产生的OPG是一种可溶性糖蛋白。它作为“饵”受体可以阻止RANKL与RANK的结合，从而抑制RANKL介导的破骨细胞生成作用。RANKL、RANK和OPG的相互作用维持着骨骼稳态，使溶骨活动和成骨活动达到动态平衡。骨微环境中，RANKL与OPG的动态平衡是骨骼稳态的基础。成骨细胞除了通过分泌RANKL与OPG来调节骨骼重塑平衡外，也可以通过分泌PTH对OPG-RANKL-RANK系统进行调节。成骨细胞分泌的PTH以自分泌或旁分泌的方式作用于成骨细胞表面的PTH受体（PTHreceptor，PTHR），以此来促进成骨细胞表达RANKL并抑制其表达OPG。因此，PTH的总效应是促溶骨。在机体正常生理状况下，PTH促溶骨效应与OPG-RANKL-RANK系统相互协调共同维持机体骨骼稳态。
（三）成骨细胞成骨作用与Wnt通路
*近的研究已经表明Wnt通路是成骨细胞功能和骨质形成的关键调控因素。激活Wnt/β-catenin信号通路可促进合成骨基质胶原前体以增加骨量。Wnt通路有多条，其中Wnt/β-catenin通路是研究得*广泛的通路。目前已经发现有19种Wnt蛋白，其中7种Wnt蛋白可以激活这条通路，它们分别为Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt8和Wnt10b。Wnt配体与细胞表面的Wnt受体（Fzs和LRP-5/6共受体）结合，从而激活胞内蛋白Dvl，激活的Dvl蛋白可以抑制GSK-3β，*终增加β-catenin含量。β-catenin蛋白作为转录因子促进成骨细胞分化及骨基质胶原前体合成。此外，研究发现Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤细胞中可以激活一些特殊基因，如Axin-2、c-myc和cyclinD1，以此来调节多种生物过程，如促进肿瘤细胞生长、分化、侵袭和转移。
（四）破骨细胞溶骨作用与组织蛋白酶K
组织蛋白酶是一种溶酶体蛋白酶，属于木瓜样半胱氨酸蛋白酶家族，主要表达于破骨细胞内。破骨细胞释放组织蛋白酶K，积极地参与骨质流失的过程（图1-1）。这种半胱氨酸蛋白酶在骨基质降解中起着关键的作用，其所参与反应在破骨细胞骨吸收过程中是一个限制性步骤。组织蛋白酶K以剪切胶原螺旋和末端肽域的方式降解骨胶原，这不仅破坏了骨细胞外基质的主要成分，而且使胶原中隐藏的精氨酸（Arg）-甘氨酸（Gly）-天冬氨酸（Asp）序列（RGD序列）暴露，此序列对破骨细胞黏附于细胞外基质至关重要。这种黏附有利于破骨细胞进一步发挥溶骨作用。
二、骨转移瘤骨骼生物学
（一）骨微环境促肿瘤效应
骨微环境中的多种细胞均有利于骨转移，包括基质细胞、破骨细胞和短暂性细胞。基质细胞来源于骨髓内间充质干细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞和成骨细胞（“三系分化”）。它们通过相关分子，如血管细胞黏附分子-1、多配体聚糖和基质金属蛋白酶2，促进肿瘤细胞增殖和分化。破骨细胞溶骨释放出许多潜在性的生长刺激分子，也有利于肿瘤细胞在骨微环境中生长。目前，没有明确的研究将骨溶解增加与肿瘤细胞量增加联系在一起，但是抑制骨质溶解能降低骨内肿瘤负荷。短暂性细胞包括红细胞、T细胞和血小板，已经证明这些细胞均可通过多种通路和分子促进肿瘤生长和转移。
（二）成骨细胞“双重”调节失衡与“恶性循环”
肿瘤一旦定植到骨骼，成骨细胞的“双重”调节稳态将逐渐被打破，并且导致骨转移瘤细胞、成骨细胞和破骨细胞之间形成“恶性循环”。骨微环境中肿瘤细胞分泌的生长因子，如甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）、FGF、PDGF、骨形态形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和IGF1，可以促进成骨细胞产生和释放RANKL；肿瘤细胞分泌的因子，如PTHrP、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、Dickkopf-1（DKK-1）或者上皮生长因子，又可降低基质和成骨细胞表达OPG。所以，肿瘤侵犯骨骼的作用机制是RANKL与OPG的比值上调，成骨细胞“双重”调节稳态被打破。RANKL与破骨细胞上的RANK结合促进破骨细胞释放组织蛋白酶K。组织蛋白酶K分解骨胶原，使骨质中的多种生长因子释放入骨微环境。这些生长因子促进肿瘤细胞生长、生存、侵袭和局部转移。因此，肿瘤细胞促溶骨效应与溶骨释放生长因子促肿瘤效应构成了溶骨-肿瘤生长侵袭的“恶性循环”（图1-2）。
（三）PTHrP介导“恶性循环”
已经证实多种恶性肿瘤细胞过度产生PTHrP。肿瘤源性PTHrP是形成破骨细胞的主要诱导因子，并且它的表达对骨转移瘤微环境是特异性的。乳腺癌细胞产生的PTHrP与成骨细胞上的PTHR结合，诱导其表达RANKL，同时降低OPG的表达。因此，溶骨性活动增强。并且，PTHrP也可结合于基质细胞的PTHR，刺激其产生RANKL。过度激活的成熟破骨细胞溶解骨质，随后释放骨源性IGF-1和TGF-β。IGF-1通过激活信号分子（包括PI-3激酶、Akt和NF-κB）产生瀑布效应刺激乳腺癌细胞生长和转移。TGF-β通过促进PTHrP的产生来促进骨转移瘤发生，这也会促进破骨细胞性骨质溶解的“恶性循环”。
三、分子靶向治疗
（一）双膦酸盐
双膦酸盐（diphosphate，BP）是唯一对骨矿化基质有亲和力的药物，它能抑制骨溶解。这些制剂通过进入破骨细胞和抑制法尼基焦磷酸合酶（生物合成甲羟戊酸途径的关键酶）以降低溶骨和增加骨骼矿化（图1-3）。含氮双膦酸盐的抗溶骨活性*强。其中，唑来膦酸是唯一在所有转移性骨病灶类型中均有效的静脉内给药BP，而且目前认为唑来膦酸是临床上*有效的BP制剂。BP也是*常用来预防乳腺癌骨转移患者SRE的重要药理学制剂。这些制剂与安慰剂对照的Ⅲ期临床试验meta分析提示静脉内注射BP预防SRE优效于口服BP。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了唑来膦酸和帕米膦酸特异地治疗骨转移瘤，使用指南见表1-1。
一项乳腺癌或者多发性骨髓瘤源性骨转移瘤的长期研究揭示：唑来膦酸与帕米膦酸相比，唑来膦酸显著降低了需要放射治疗患者的比例（分别为19%和24%；P=0.037）。乳腺癌患者组中，唑来膦酸与帕米膦酸相比，唑来膦酸治疗组患者的SRE发生率下降了40%（P=0.125），唑来膦酸也使任何SRE风险下降了20%。
使用BP治疗后，相关的重要不良反应包括贫血、胃肠道症状（恶心、呕吐、腹泻或者便秘）、疲劳、发热、无力、关节疼痛、肌肉疼痛和低钙血症（不常见）。BP的肾毒性促使FDA推出警示：BP治疗前需要检测肌酐水平。*近发现BP导致颌骨坏死，*常见于氨基BP。因此，推荐患者进行牙科相关检查。
（二）地舒单抗
地舒单抗（全人源单克隆抗体）特异性结合RANKL，阻断RANKL与RANK的结合，从而阻断肿瘤促溶骨效应与溶骨促肿瘤效应的“恶性循环”。因此，其抑制了过度激活的破骨细胞成熟和功能活性，减缓了骨转移瘤的进展和转移。2010年11月19日，FDA批准了地舒单抗运用于有骨质破坏的骨转移瘤患者预防SRE。其使用指南见表1-1。地舒单抗在临床上的安全性和有效性是值得肯定的。
一项比较地舒单抗和唑来膦酸的随机、双盲临床研究（地舒单抗组，n=2862；唑来膦酸组，n=2861）证实了地舒单抗的安全性和有效性。结果表明：在乳腺癌或前列腺癌患者中，地舒单抗在延迟SRE发生方面优效于唑来膦酸（HR=0.82；95%CI0.71～0.95），疾病进展、整体生存期和不良反应发生率相近；在晚期多发性骨髓瘤和其他实体瘤中，地舒单抗在延迟SRE发生方面非劣效于唑来膦酸（HR=0.84；95%CI0.71～0.98），疾病进展、整体生存期和不良反应发生率相近。*近，研究者在考虑患者多种基础变量的情况下，以第一次SRE和多次SRE发生时间为终点继续分析。这些基础变量包括：骨转移瘤位置（脊柱或四肢）、是否有器官转移、尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽（uNTX）水平（平均值≥43.5nMBCE/mMCr或＜43.5nMBCE/mMCr）、骨转移瘤的数量（＜2或≥2）及美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分。结果发现，无论患者的基础变量特性如何，地舒单抗与唑来膦酸相比，地舒单抗均能明显地延迟第一次SRE和多次SRE的发生时间。
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