第1章 国内外研究概览
1.1 eRF3/GSPT蛋白
1.1.1 eRF3的来源
1.1.2 eRF3的结构特征
1.1.3 eRF3a的功能
1.2 Survivin蛋白
1.2.1 Survivin的来源及其家族
1.2.2 Survivin的定位和结构特征
1.2.3 Survivin的功能
1.3 miRNAs
1.3.1 miRNAs的来源
1.3.2 miRNAs的形成及作用原理
1.3.3 miRNAs的功能
1.4 本书研究目的、意义及创新点
1.4.1 研究目的及意义
1.4.2 研究创新点
第2章 miR-144通过调控eRF3a/GSPT1对细胞增殖、迁移的影响研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞及菌株miRNA介导GSPT与Survivin蛋白互作及功能调控
2.1.2 细胞与菌株的质量控制
2.1.3 质粒及microRNA模拟物
2.1.4 主要的酶及试剂
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 双荧光素酶报告质粒的构建
2.2.3 质粒转染
2.2.4 RNA干扰
2.2.5 RNA提取及实时荧光定量qPCR
2.2.6 miRNA的提取及实时荧光定量qPCR
2.2.7 细胞增殖活性MTT检测
2.2.8 划痕实验
2.2.9 Westernblot
2.3 结果
2.3.1 GSPT1和miR-144在结肠癌细胞HCT116细胞中的表达水平检测
2.3.2 GSPT13′UTR是miR-144的靶物
2.3.3 miR-144通过下调GSPT1抑制细胞增殖
2.3.4 miR-144通过下调GSPT1抑制细胞迁移
2.4 讨论
第3章 Survivin70、71位氨基酸突变体对结肠癌细胞增殖、迁移的分子调控
3.1 材料
3.1.1 实验细胞株、菌株与质粒
3.1.2 试剂及工具酶
3.2 方法
3.2.1 点突变
3.2.2 pull-down技术
3.2.3 Survivin突变体与eRF3的共定位
3.3 结果
3.3.1 Survivin70、71位氨基酸突变测序图
3.3.2 Survivin70、71位氨基酸的突变体重组蛋白的表达
3.3.3 Survivin70、71位氨基酸的突变对与eRF3a/GSPT相互作用的影响
3.3.4 Survivin70、71位氨基酸的突变对Survivin/Survivin二聚体形成的影响
3.3.5 Survivin及其70、71位氨基酸突变体与GSPT1的定位
3.3.6 Survivin70、71位氨基酸的突变抑制了结肠癌细胞HCT116增殖
3.3.7 Survivin70、71位氨基酸突变抑制了结肠癌细胞HCT116迁移
3.3.8 Survivin70、71位氨基酸的突变促进了细胞凋亡
3.3.9 Survivin70、71位氨基酸的突变提高了其对顺铂药物的敏感性
3.4 讨论
3.5 结论与展望
第4章 人类截短型GSPT1蛋白与生存素Survivin在体内相互作用及区域分析
4.1 材料
4.1.1 菌株与质粒
4.1.2 寡聚核苷酸
4.1.3 工具酶及生化试剂
4.1.4 主要试剂的配制
4.2 方法
4.2.1 eRF3截短体的酵母双杂交重组质粒构建
4.2.2 eRF3截短体酵母双杂交重组质粒的共转化
4.2.3 β-半乳糖苷酶活性分析
4.2.4 阳性克隆的严谨型筛选
4.2.5 荧光共定位miRNA介导GSPT与Survivin蛋白互作及功能调控
4.3 结果
4.3.1 eRF3N末端区域截短设计
4.3.2 截短体构建方案
4.3.3 实验设计原理
4.3.4 截短体功能预测
4.3.5 截短型eRF3a/GSPT1、eRF3b/GSPT2酵母双杂交重组质粒的构建和鉴定
4.3.6 β-半乳糖苷酶活性分析
4.3.7 eRF3与Survivin共定位
4.4 讨论
第5章 人类肽链释放因子eRF3与生存素Survivin在体外相互作用及区域分析
5.1 材料
5.1.1 菌株与质粒
5.1.2 寡聚核苷酸
5.1.3 主要酶及生化试剂
5.1.4 主要试剂的配制
5.2 方法
5.2.1 原核重组表达质粒的构建
5.2.2 eRF3a截短体原核表达重组质粒的转化与量诱导表达
5.2.3 重组蛋白的大量表达
5.2.4 pull-down分析
5.2.5 Westernblot分析
5.3 结果
5.3.1 eRF3截短体原核表达重组质粒的构建
5.3.2 eRF3不同截短体蛋白的原核表达
5.3.3 体外相互作用的pull-down分析
5.4 讨论
5.4.1 相互作用研究的系统验证
5.4.2 细胞周期调控的协同作用假说
5.4.3 待解决的关键科学问题
5.4.4 未来研究方向
5.5 总结与展望
5.5.1 总结
5.5.2 展望
展开
