第1章 酶工程发展历程与展望
　　张媛媛 王钦宏 马延和
　　中国科学院天津工业生物技术研究所
　　酶（enzyme）是能够催化生物化学反应的生物催化剂（biocatalyst），它可以使反应的活化能降低进而加快反应速率。酶在化学反应中与其他催化剂相同，不会被消耗，也不影响化学平衡。但不同之处在于酶具有更强的特异性（specificity）。酶的活性受到温度、pH、溶剂、金属离子以及其他分子［抑制剂（inhibitor）或者激活剂（activator）］的影响，会改变其结构及催化性能。自认识与发现酶以来，许多酶已经实现了商业化开发，在医药、化工、食品、农业、环境、饲料、能源等领域实现了广泛应用。作为绿色催化剂，酶完全符合现代安全、健康和环境标准。尽管酶具有无与伦比的催化特性，但是在实际应用中，其活性、催化效率、稳定性、底物特异性、产物选择性等经常难以满足需求，需要对酶进行筛选、修饰、优化和改造以满足工业应用的需要。酶工程（enzyme engineering）是筛选、修饰、优化和改造酶以获得所需物理和催化特性的过程。在生物科学迅猛发展且与信息科学、材料、化学等多学科交叉的大环境下，不仅可以从特定环境、从生物大数据中快速获得目标酶，而且可以通过对特定的基因序列进行设计、改造甚至从头合成获得理想的酶，以实现特定的应用。
　　1.1 酶的发现、认识与酶工程诞生
　　1.1.1 酶的发现与认识
　　人类对酶的认知经历了一个不断发展、逐步深入的过程，在这个过程中一大批科学先驱做出了杰出的贡献（图1.1）。我国和两河流域的人们很早就开始利用酶或微生物制造酒、酱、面包等。早在6000多年前的巴比伦人就有啤酒的酿造历史记录，5000多年前的阿拉伯人利用羊胃膜凝乳酶制造干酪。我国利用酶的历史也非常悠久，4000多年前的夏禹时期就掌握了酿酒技术，3000多年前的周朝已经开始制造酱、饴糖等。然而，古代人们对酶的应用单纯依赖于观察和重复实践，并非利用科学技术。
　　图1.1 酶的发现与认识重要活动情况
　　到17世纪末和18世纪初，胃分泌物对肉类的消化和唾液将淀粉转化为糖类的过程已为人所知，但这些过程的发生机制尚未确定。1773年意大利科学家拉扎罗 斯帕兰扎尼（Lazzaro Spallanzani，1729 — 1799年）发现鹰的胃液可以消化肉块；1833 年法国化学家安塞尔姆 佩恩（Anselme Payen，1795 — 1878年）第一个发现了淀粉酶。1857年法国科学家路易斯 巴斯德（Louis Pasteur，1822 — 1895年）在研究酵母将糖发酵成酒精时，发现此过程是由酵母细胞中一种称为“发酵”的重要力量引起的，这种力量被认为只在活生物体中发挥作用。他写道：酒精发酵是一种与酵母细胞的生命和组织有关的行为，而不是与细胞的死亡或腐烂有关。1877年德国生理学家威廉 库内（Wilhelm Kühne，1837 — 1900年）首次提出“enzyme”（来自希腊文.νζυμον，其含义为“在酵母中”，中文译为“酶”）这一术语来表述催化活性。酶这个词后来被用来指代胃蛋白酶等非生命物质，而发酵这个词被用来指代生物体产生的化学活性。德国化学家爱德华 布赫纳（Eduard Buchner，1860 — 1917年）于1897年提交了他的第一篇关于酵母提取物研究的论文，发现即使混合物中没有活酵母细胞，糖也会被酵母提取物发酵，他将导致蔗糖发酵的物质命名为“酶”；他于1907年获得诺贝尔化学奖，获奖的原因是他发现了“无细胞发酵”。
　　在20世纪90年代初，酶的生化特性仍然未知，许多科学家观察到酶活性与蛋白质有关。1926年美国生物化学学家詹姆斯 萨姆纳（James Sumner，1887 — 1955年）第一次将脲酶结晶从刀豆中提取出来，证实酶的本质是蛋白质，这才使得之后人们对酶的蛋白质本性和催化机制开始了深入研究，这为酶化学和蛋白质化学的发展奠定了基础，他在1937年对过氧化氢酶进行了同样的研究。美国生物化学家约翰 诺斯洛普（John Northrop，1891 — 1987年）和温德尔 斯坦利（Wendell Stanley，1904 — 1971年）明确证明了纯蛋白质可以是酶的结论，他们对胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶进行了深入的探究，三位科学家于1946年荣获了诺贝尔化学奖。酶能够结晶的结论最后可用X 射线晶体学分析它们的结构来验证，第一个获得晶体结构的酶是溶菌酶，溶菌酶是一种存在于眼泪、唾液和蛋清中的酶，可以消化某些细菌的外皮。该结构是由英国结构生物学家大卫 菲利普斯（David Phillips，1924 — 1999年）领导的一个小组解析的，并于1965年发表。溶菌酶的这种高分辨率结构标志着结构生物学领域研究的开始，促进在原子水平的细节上了解酶的工作原理。
　　20世纪80年代初期，美国科学家托马斯 切赫（Thomas Cech，1947年 — ）和西德尼 奥尔特曼（Sidney Altman，1939年 — ）均独自发现RNA能够催化生化反应，拥有生物催化特性，切赫将具有这一功能的物质命名为核酶（ribozyme），也被称为RNA催化剂。这一发现打破了之前仅有蛋白质才拥有催化特性的固有认知，因此1989年两位科学家获得了诺贝尔化学奖。现在自然环境中的很多种核酶已被发现，现今能够用来反式切割靶RNA的核酶主要有发夹状核酶、锤头状核酶、大肠杆菌RNase P、四膜虫自身剪接内含子4种核酶（Heckmann and Paradisi，2020）。
　　1.1.2 酶的命名和分类（一基因一酶假说）
　　早期主要由酶的发现者根据其所催化反应的底物、反应的类型或酶的来源来命名。例如，催化脂肪的酶命名为脂肪酶，催化蛋白质的酶命名为蛋白酶，催化淀粉的酶命名为淀粉酶；而依据来源不同又可将蛋白酶命名为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。但有些反应可以由几种不同的酶催化，这些酶称为同工酶（isozyme），而上述的命名法无法处理同工酶的情形。所以，国际生物化学与分子生物学联盟（The International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUBMB）颁布了酶的命名法以规范酶的命名与分类。第一届酶学委员会对酶的系统性和逻辑性命名问题进行了很多思考，最后建议酶应该有两种命名法，一个系统名称和一个习惯名称。酶的系统名称按照一定的规则形成（EC编号），尽可能准确地显示酶的作用，从而准确地识别酶。每种酶由“EC”描述，后跟4个数字的序列，代表酶活性的等级（从非常普遍到非常具体）。也就是说，第一个数字根据其机制对酶进行了广泛的分类，而其他数字则增加了越来越多的特异性。由于烦琐，引入系统名称受到强烈批评。酶学委员会详细讨论了这个问题，并改变了重点，决定在酶列表中更加突出通用名称，它们紧跟在代码编号之后。尽管如此，保留系统名称作为分类的基础还是非常必要：①在酶列表中查找酶，作为系统名称的代码编号可以更好地用于识别酶；②系统名称可以更好地强调反应类型；③发现者可以通过标准规则给新酶命名系统名称；④新酶的通用名称通常是系统名称的缩写形式，这样系统名称有助于找到符合一般模式的通用名称。在发表酶不是主题的论文或报告时，一般应使用通用名称，但应在第一次提及时通过其代号和来源进行识别。如果发表酶是主题的论文或报告时，则应在首次提及时提供其代号、系统名称或反应方程式和来源；此后应使用通用名称。鉴于酶名称和代号指的是催化反应，因此提供酶的来源以进行全面鉴定是特别重要的。当论文或报告涉及酶列表中尚未包含的酶时，作者可以引入新名称，如果需要，还可以引入新的系统名称，两者均根据推荐规则形成。编号只能由IUBMB的命名委员会分配。
　　1961年IUBMB酶学委员会依据酶的催化作用，颁布了酶的分类方法，依据酶催化生物化学反应的类型将其分成六大类（表1.1）：连接酶、异构酶、裂合酶、转移酶、水解酶、氧化还原酶（Tipton and Boyce，2000）。其中具有最丰富的酶形式的是氧化还原酶、水解酶，研究表明，现今在进行生物转化时60%选择水解酶，20%选择氧化还原酶（Straathof et al.，2002）。根据底物的化学名称及其反应机制，进一步系统地划分各个酶类别。
　　表1.1 酶的分类
　　酶的命名方法是在底物名称后加上后缀——ase。然而，也有一些酶的名字并不包含底物名称，如胃蛋白酶（pepsin）和胰蛋白酶（trypsin）。为避免歧义，国际酶学委员会为每种酶命名时增加了一个四级编号。第一、第二、第三和第四个数字分别代表六大类酶中的某一大类、按底物类型或断裂化学键划分的亚类、按失去基团电子受体类型划分的亚亚类和酶的序列号。例如，乳酸脱氢酶的系统编号为［EC1.1.1.27］（图1.2）。
　　图1.2 酶的系统编号（以L- 乳酸脱氢酶为例）
　　酶除按照上述以酶活性（EC分类）进行分类外，也可以按照酶的氨基酸序列相似性进行分类。EC分类不反映序列相似性。例如，催化完全相同反应的相同EC编号的两个连接酶可以具有完全不同的序列。酶像任何其他蛋白质一样，可以根据它们的序列相似性分为许多家族，而不是按照其功能划分，这些家族已被记录在许多不同的蛋白质和蛋白质家族数据库中，如iPfam等。
　　1.1.3 酶结构功能与作用机制
　　1. 酶的结构
　　酶通常为球形蛋白质，独自或结合成更大的复合物来发挥其功能。酶的结构取决于其一级结构（氨基酸序列），同时酶的催化活性也取决于其自身结构。尽管结构决定功能，但仅从结构还不能完全预测新的酶活性。当酶处于加热、低pH、高pH环境或暴露于化学变性剂时，酶结构会展开（变性），这种对结构的破坏通常会导致酶活性丧失。酶变性通常与高于物种正常水平的温度有关。因此，处于高温环境（如温泉等）中的物种产生的酶因具有在高温下发挥作用的能力而在工业应用上受到青睐。
　　酶通常比它们的底物大得多，大小范围可以是几十个氨基酸残基（例如，4- 草酰巴豆酸互变异构酶，62个残基）到数千个氨基酸残基（动物脂肪酸合酶，2500多个残基）。大多数情况下，酶只有一小部分结构（2 ～ 4个氨基酸）直接参与催化（催化位点，catalytic site）。催化位点位于一个或多个结合位点（binding site）旁边；结合位点的残基使底物定向，促进催化反应进行。酶的活性位点（active site）是由结合位点、催化位点一同组成的。而活性位点的精准定位及动力学要依靠其他位于酶结构中的大多数氨基酸残基来维持。在某些酶中，没有氨基酸直接参与催化作用；这些酶包含结合和定向催化辅助因子（cofactor）的位点。酶结构也可能包含变构位点（allosteric site），其中小分子的结合会导致构象变化，从而增加或减少酶的活性。
　　2. 酶的底物结合机制
　　酶必须先与其底物结合（substrate binding），然后才能催化反应进行。酶通常对它们结合的底物和催化的化学反应非常专一。通过将具有互补形状、电荷和亲水/疏水特性的口袋与底物结合来实现特异性。因此，酶可以区分非常相似的底物分子，使其具有化学选择性（chemoselectivity）、区域选择性（regioselectivity）和立体特异性（stereospecificity），有些呈现出很高的准确性与特异性。例如，参与基因复制、基因表达的酶可以发挥精确“校对”作用，DNA聚合酶等酶在第一步催化反应后，第二步检查产物是否正确，这种两步过程导致高保真哺乳动物聚合酶在1亿次反应中的平均错误率小于1次。相反，一些酶表现出泛杂性（enzyme promiscuity），具有广泛的特异性并作用于一系列不同的相关底物。