实验室守则
学生在实验室有时可能接触感染性病原微生物，为了防止实验室污染和人员感染、确 保安全及实验课顺利进行，学生进入实验室后必须严格遵守以下规定。
1.进人实验室时必须穿好白大衣，不许穿拖鞋，无关物品不许带人室内。
2.实验室内严禁吃任何食品和饮料，严禁吸烟。
3.保持肃静，严禁喧哗打闹和随意走动，切勿互相碰撞，以免出现意外事故。
4.应按照实验教程在教师严格指导下进行实验。对实验材料(特别是灭菌材料及含活 菌材料)和实验操作有不明白之处，应仔细阅读实验教程或询问老师弄明白后再正确使用和 操作，以期获得正确实验结果并确保安全。
5.牢固树立安全意识，在使用感染性实验材料过程中应遵守以下规定。
(1)接触过感染性材料或活菌的吸管、玻片等实验器材，用后应立即投人盛有来苏水 的消毒缸内浸泡，其余废弃物及器材应放在指定地方统一处理。
(2)如不慎将感染性材料污染桌面、地面、书本和衣物，桌面或地面应立即用2%来 苏水冲洗，书本应用紫外线灯照射半小时，衣物应用苯扎溴铵水浸泡洗净。
(3)若手上沾有活菌，应立即将手在2%来苏水中浸泡5分钟左右，再用清水冲洗干 净；若不慎将活菌吸人口中，应立即吐到来苏水缸内，然后用2%硼酸水充分漱口，必要 时内服抗菌药物；若活菌溅人眼睛内，应立即用1%蛋白银或眼药水冲洗眼睛。
6.实验结束后，需孵育的培养物应放至指定的温箱，要按规定时间及时认真观察、正 确记录和分析实验结果，并按时独立完成实验报告。所有微生物培养物观察完毕后务必送 洗涤室灭菌处理，不得随手乱放，更不得带出实验室。
7.爱护公物，注意节约实验材料和水电，如损坏实验仪器和器材，应立即向老师报告 并进行登记，按学院有关规定赔偿。
8.保持室内整洁，下课后应归放整理好实验器材，用2%来苏水擦洗实验桌面和地面， 用消毒液泡手并冲洗干净，脱下白大衣反折好，关好水电门窗后，方可离开实验室。
第一篇免疫学实验
实验一常规免疫学诊断技术
目的要求
(1 )熟悉血清学反应的基本原理、反应条件、反应现象及实际应用意义。
(2)掌握凝集反应和琼脂扩散的实验操作和结果判定方法。
(3)了解其他免疫学诊断技术的基本原理、操作方法和结果判定方法。
实验内容
一种抗原分子只能与由它刺激产生的对应抗体髙度特异结合而发生反应。抗原特异性 取决于抗原表位的化学基团性质、数目及其立体构型，而抗体特异性则取决于V区的抗原 结合部位与相应抗原表位空间构象吻合的程度。由于抗原与抗体的结合具有高度特异性， 因此可利用已知抗体鉴定标本中的未知抗原（或反过来）。
应用免疫学理论和技术进行诊断是医学免疫学的一项基本内容，而常规免疫学诊断技 术即是利用体外抗原抗体反应（也称为血清学反应）原理设计的。目前，*为常用的免疫 学诊断技术包括凝集反应、沉淀反应、琼脂凝胶免疫电泳、免疫荧光标记、酶免疫技术及 补体结合实验等。
在进行体外抗原抗体反应时，当抗原和抗体分子比例*合适时，抗原与抗体结合充分， 形成的抗原抗体复合物大且多，出现明显可见反应现象，上清液中几乎无游离的抗原或抗 体存在，称为抗原抗体反应的等价带（即平衡区）。当抗原量太少而抗体量太多（抗体过 剩）时无沉淀物形成，称为前带现象；而当抗体量太少抗原量太多（抗原过剩）时，称为 后带现象。前带现象与后带现象均不会出现可见反应。
测定抗原抗体分子比例是否合适，在进行沉淀反应时，一般用抗原稀释法，即抗体恒 量而抗原做系列稀释（如下述单向琼脂扩散实验）；在进行凝集反应时，一般用抗体稀释 法，即抗原恒量而抗体做系列稀释（如下述外斐反应）;或者用更为精确的抗原与抗体方 阵滴定法。
一、凝集试验
当抗原或抗体其中一种物理状态为颗粒时，抗原与对应抗体特异性结合后，在电解质 溶液中颗粒逐渐聚集，形成可见凝集块，称为凝集反应（agglutination reaction)。此反应可分为直接凝集反应（direct agglutination reaction)和间接凝集反应（indirect agglutination reaction)。
1.直接凝集反应在适宜电解质溶液中，天然颗粒性抗原悬液与其对应抗体发生特 异性结合，抗体可将颗粒性抗原交叉连接，形成肉眼可见的凝集块，称为直接凝集反 应（图1-1 )。
图1-1直接凝集反应原理示意图
2.间接凝集反应将可溶性抗原吸附于适当的微小颗粒载体表面，称之为抗原性致敏 颗粒；若将抗体Fc段吸附于颗粒载体表面，则称之为抗体性致敏颗粒，此颗粒表面的Ig-V 区仍可以与对应抗原特异性结合。常用的颗粒载体有红细胞（间接血凝反应)、胶乳颗粒、 明胶颗粒、SPA+金黄色葡萄球菌（协同凝集反应）等。
在适宜电解质溶液中，致敏颗粒与相应抗体（或抗原）特异结合后，可出现凝集现象， 称为间接凝集反应。
间接凝集反应可分为（正向）间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应 和协同凝集反应四类。
(1)(正向）间接凝集反应：诊断试剂为标准抗原的致敏颗粒，如果被检样品与抗原 致敏颗粒混合后出现凝集现象，说明标本中含有对应抗体，此为凝集阳性反应。
(2)反向间接凝集反应：诊断试剂为诊断抗体的致敏颗粒，如果被检样品与抗体致敏 颗粒混合后，凝集阳性反应说明标本中含有与诊断抗体对应的抗原。
(3)间接凝集抑制反应：诊断试剂为标准抗原致敏颗粒及其对应诊断抗体。先将被检 样品与诊断抗体混合反应，再加入标准抗原致敏颗粒。若检测样品中含有与标准抗原相同 的抗原，则没有诊断抗体与抗原致敏颗粒结合，不会出现凝集现象，此为阳性反应，说明 被检样品中含有目标抗原。
(4)协同凝集试验：诊断试剂为诊断抗体致敏的SPA+金黄色葡萄球菌。大多数金黄 色葡萄球菌细胞壁上有葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA)。SPA是C末 端连接在金黄色葡萄球菌细胞壁上的一条肽链，其胞膜外肽链部分有4个可与人类或动物 的IgG-Fc段结合的活性区段Q当SPA与IgG-Fc结合后，IgG-Fab仍保持与相应抗原分子 特异性结合的能力，利用这一特性检测各种可溶性抗原的方法，称为协同凝集试验。
在凝集反应中，IgM的凝集作用很强，与对应抗原形成的凝集块大，易于肉眼观察； 而IgG凝集作用较差，若与抗原分子比例不太合适时，可能出现不完全凝集反应，即所形 成的Ag-IgG复合物小而肉眼不可见。此夕卜，因Z电位（zeta potential)可使颗粒互相排斥，适当增加电解质浓度可降低Z电位，促使凝集块形成。
(一）人ABO血型鉴定——玻片凝集试验
玻片凝集试验(slide agglutination test)是在载玻片上进行的直接凝集反应，通常是将 已知抗体(诊断血清)与适量未知颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)悬液在载玻片上混匀， 若出现凝集现象，说明未知抗原与已知抗体特异对应，为定性试验，常用于细菌种属鉴定、 人类 ABO 血型鉴定(determine blood type)等。
1.材料
(1)样品：自身手指血。
(2 )诊断试剂：抗A血型定型试剂，抗B血型定型试剂。
(3)其他：无菌采血针，无菌毛细吸管，灭菌生理盐水(normalsaline， NS；分装小 试管：0.5 ml/i)，载玻片，2.5%碘酒棉球，75%乙醇溶液棉球，灭菌干棉球等。
2.方法
(1)采血：用2.5%碘酒棉球消毒待检者的手指尖端，用75%乙醇溶液棉球脱碘，待 干或用干棉球擦干。用采血针刺破手指，挤出血，用无菌毛细吸管采血1？2滴放人小试 管内，与生理盐水混匀成红细胞悬液。
(2)取清洁玻片1张，用油性笔在两边上角标注“A”或“B”，分别在与A或B对 应位置上各加1滴抗A或抗B血型定型试剂。
(3 )用毛细滴管吸取待检红细胞悬液，分别各加1滴于抗A或抗B血型定型试剂中。
(4)手持玻片前后倾斜摇动，以使红细胞悬液与血型定型试剂充分混匀（注意切勿使 “A”和“B”两边液体相混）。
3.结果边摇边观察有无凝集发生，发生凝集时可见液体澄清，红细胞凝集成小血块; 无凝集者红细胞呈均匀分散（彩图1 )。若10min仍无凝集，判断为阴性结果。如观察不清，可置低倍镜下检査。记录检査结果，参考表1-1判断被检者血型。
(二）试管凝集试验
试管凝集试验（tube agglutination test)是定性和半定量试验，常用已知抗原检测血清中的相应特异性抗体及其含量，以辅助诊断疾病。一般将被检测血清样品在试管内做递减系列稀释，然后在每支试管 中加人定量的已知颗粒性抗原（如标准菌种）悬液。若出现凝集现象，说明被检血清样品 中含有与已知抗原特异对应的抗体，把出现凝集程度为“++”的血清*高稀释倍数作为样 品中抗体的效价（或滴度），是定性和半定量试验，如外斐反应、肥达反应等。
具体操作方法参考本实验内容六（一）外斐反应。
二、琼脂扩散试验
可溶性抗原与其相应抗体结合形成肉眼可见的沉淀线或环，称为沉淀反应(precipitation reaction)。根据操作方法和反应介质不同，分为液体中沉淀试验和琼脂扩散 试验(agar diffusion test)。目前琼脂扩散试验应用*广。
琼月旨（agar)是从石花菜、紫菜、江篱等大型海藻类植物提取出来的藻胶类物质，由 琼脂糖(agarose)和琼脂果胶（agaropectin)组成。琼脂糖是一种由1，3连接的半乳 糖和1，4连接的3，6-脱水a-D-半乳糖交替组成的线状多聚糖，琼脂果胶是许多结构相似 的小分子异质混合物，带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差且会造成电内渗。琼脂具有亲水 性，极少引起生物大分子变性和吸附，是理想的惰性载体；而且，由于几乎不被细菌、真 菌等水解，因此是微生物固体培养基的*佳固形剂。
琼脂（粉）在水中加热到90°C以上溶化成液状，温度下降至约45°C以下时凝结成 半固体状的凝胶。在浓度适宜的琼脂凝胶中，琼脂糖纤维聚集成胶束，胶束之间形成 微孔状网格，将水分固化。抗原及抗体等蛋白质分子由于分子质量较小，可在凝胶网 孔之间的液体中自由扩散。当抗原与抗体结合形成免疫复合物时，由于分子质量常在 百万以上，受凝胶网格孔径的限制，不能自由运动，因此在抗原与抗体相遇处停滞， 形成沉淀物。
常用的有双向扩散和单向扩散试验。
(一)双向琼脂扩散试验
在琼脂板上间距适当地打一对孔（或者梅花孔、双排孔、三角孔等），在孔中分别加 入可溶性抗原或抗体（图1-2上），当两者自由扩散相遇时可特异性结合，在抗原抗体分子比例合适处可成肉眼可见的沉淀线（图 1-2下），称为双向琼脂扩散（double immu-nodiffusion )试验。由于不同的抗原抗体在 琼脂中扩散的速度不同，而一对抗原抗体系 统只能形成一条沉淀线，所以在琼脂凝胶 中，每一条沉淀线均代表着一对特异对应的 抗原和抗体。因此该法主要优点是能够对抗 原成分进行精细分析。
1.血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein， AFP)检测
1)样品：待检患者血清。
2)试剂：AFP诊断血清，脐带（AFP阳性）血清，健康人（AFP阴性）血清，1.2% 生理盐水琼脂凝胶。
3)器材：玻璃平皿（Φ60 mm)，打孔器（Φ5 mm)，微量加样器等。
(2)方法
1)制备琼脂凝胶板：取洁净060 mm玻璃平皿1块，加已煮沸溶化的1.2%琼脂凝胶 10ml，铺成约4 mm厚的琼脂凝胶
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