第一篇 细胞遗传学实验模块
　　第一章 细胞遗传学实验基础知识
　　细胞遗传学是一门遗传学与细胞学相结合的遗传学分支学科，着重研究遗传现象的染色体基础、染色体行为的遗传学效应等。从 1910年到 20年代中期，美国遗传学家摩尔根（Thomas Hunt Morgan）与学生利用果蝇作为研究材料，证实了基因在染色体上呈线性排列，建立了遗传的染色体学说。在这一基础上，细胞遗传学迅速发展起来。
　　第一节 细胞分裂过程中的染色体行为
　　除少数生物如 RNA病毒和朊病毒外，绝大多数生物的生命活动都与生物体内的遗传物质 DNA密切相关。DNA主要存在于染色体上，具有遗传稳定性、多样性和连续性，能够产生可遗传的变异，保证了亲代与子代之间的相似性和生物界的多样性。染色体不仅是遗传信息的载体，也是遗传信息得以有序表达的物质基础，能够准确复制和均衡分离，有规律地、均匀地分配到子细胞中。不同物种的染色体数目和形态特征差异很大，而同一物种则具有相对恒定性。染色体的数目多或少了，或者染色体发生缺失、易位、重复等均会影响生物正常的生长发育。要研究染色体的数目、形态和结构，必须熟悉染色体在细胞分裂过程中的行为特征。在高等生物中，染色体的行为特征主要涉及两种细胞分裂过程，即有丝分裂和减数分裂。
　　一、有丝分裂
　　有丝分裂是多细胞生物体细胞最主要的一种分裂和增殖方式。细胞经过有丝分裂产生两个在核遗传物质上完全相同的子细胞。有丝分裂是一个连续的过程，包括前期、中期、后期和末期（图 1.1）。两次细胞分裂之间有一个间期。在间期，染色体以染色质形式存在。多数植物的细胞周期时间为十到几十小时，整个有丝分裂期的持续时间仅占整个细胞周期的 1/10左右，而其余大部分时间处于间期。
　　图 1.1蚕豆根尖的有丝分裂过程
　　（一）前期
　　核内染色质纤丝逐渐扭曲，形成细而卷曲的染色线，进一步螺旋化为短而粗的染色体。每条染色体含有两个染色单体，呈纵向并列。核仁渐渐消失，核膜破裂，染色体分散于细胞质中，纺锤丝逐渐形成。这个时期又可细分为以下三个时期。
　　1．早前期 染色质开始螺旋卷曲形成大小不同的染色粒，分布于核内，碱性染料染色后着色较深。核仁较清晰。
　　2．中前期 染色体继续收缩，变粗变短，呈连续的线状，互相缠绕，犹如一团乱麻。核膜不易看到，核仁隐约可见。
　　3．晚前期 随着染色体进一步螺旋化程度加剧，染色单体逐渐明晰，但染色体仍然相互缠绕，并渐渐向赤道板处集结。核膜和核仁逐渐消失。
　　（二）中期
　　染色体的着丝点排列在赤道板上，两臂自由伸展，分布于赤道板两侧。两极的纺锤丝形成纺锤体，不被碱性染料着色，因此在一般制片中很难观察到，隐约可见到牵引丝分布。中期染色体图像侧面观察形似车轮辐条状，而极面观察似菊花状，便于分析染色体的形态和数目。
　　（三）后期
　　染色体的着丝点一分为二，其姐妹染色单体也相应地分开，并随着纺锤丝的牵引移向细胞两极。
　　（四）末期
　　两组染色体到达两极后开始解螺旋，纺锤体消失，核膜形成，核仁出现，原先的一个母细胞形成两个子细胞。
　　二、减数分裂
　　减数分裂是一个历时较长的连续分裂过程，在此过程中，染色体的形态、构型及行为都发生了一系列的变化。对这些变化特点的准确识别，是细胞遗传学研究的基础。减数分裂可分为减数第一次分裂和减数第二次分裂，减数第一次分裂包括前期Ⅰ（细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期）、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ，减数第二次分裂包括前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ（图 1.2）。在观察过程中，不但要注意不同时期单个染色体或二价体的基本形态，也要注意整个细胞染色体的基本构型，善于对比判断，以便得出准确结论。
　　图 1.2玉米花粉母细胞的减数分裂过程（引自李雅轩和赵昕，2006）
　　（一）前期Ⅰ
　　1．细线期 染色体呈长线状，缠绕成一团，如乱麻或鲜花状，分不出头尾。
　　2．偶线期 同源染色体开始联会，形成二价体。染色体比细线期粗，且明显松散开，一团染色体外侧能够初步判断出头和尾，有时会看到一团染色体飘出几根的现象。
　　3．粗线期 配对或联会的染色体明显缩短变粗，同源染色体的非姐妹染色单体间发生交换。染色体数目较少者，可做核型分析。有的植物的粗线期，可以看到染色较深的节状结构分布于染色体上，这一结构叫染色纽。
　　4．双线期 联会的两条同源染色体因非姐妹染色单体相互排斥而松散，但在交叉点上仍连在一起。由于交叉结的存在，有的二价体形如“麻花”状，此期还可见核仁和核膜的存在。
　　5．终变期 染色体高度浓缩，交叉向二价体的两端移动，中间交叉数目减少，二价体向核的四周边缘移动，较均匀地分散开，其形态呈现多样性，可进行染色体计数。
　　（二）中期Ⅰ
　　所有二价体分散排列在赤道板的近旁，每对同源染色体的两个着丝点朝向两极，也是染色体计数的最佳时期。
　　（三）后期Ⅰ
　　二价体的两个成员分开并移向相对的两极，但每条染色体的两条姐妹染色单体仍连在一起。
　　（四）末期Ⅰ
　　染色体到达两极后逐渐解螺旋化，变成细丝状，核仁、核膜重新出现，在赤道板区细胞质分裂，成为两个子细胞。
　　（五）中间期
　　大部分单子叶植物在减数第一次分裂和第二次分裂间存在中间期，此期持续时间很短，DNA不复制，染色体呈不完全解螺旋化，但大多数双子叶植物则没有中间期阶段。
　　（六）前期Ⅱ
　　染色体逐渐螺旋化缩短变粗，互相缠绕于核膜内，每条染色体包含两条姐妹染色单体，由一个着丝点相连。因姐妹染色单体彼此散得很开，在前期Ⅱ晚期有时可观察到“X”状或“剪刀”状形态。在小麦和玉米等植物中，染色体较短且形态不规则地分布于核膜内。
　　（七）中期Ⅱ—末期Ⅱ
　　此阶段与有丝分裂的形态和构型相似。经过减数分裂， 1个性母细胞分裂形成 4个子细胞，称为四分体或四分孢子，各呈 1/4球形。
　　第二节 染色体标本的制备流程
　　染色体是遗传物质的主要载体，染色体的形态和结构与遗传和变异现象存在一定的联系。在进行遗传分析的过程中，往往会涉及染色体的观察分析。一般情况下，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可用来观察染色体的形态和结构。
　　一、取材
　　（一）观察有丝分裂染色体的取材
　　一般来说，凡是进行旺盛细胞分裂的植物组织或单个细胞都可作为观察染色体的适宜材料，如植物的顶端分生组织（根尖和茎尖）、幼小的花、居间分生组织、愈伤组织、幼胚、胚乳和花粉。下面重点以植物为例谈谈细胞分裂的取材。
　　1．根尖 根尖包括根冠、分生区、伸长区和成熟区 4部分，其中分生区长 1～2mm，多为等直径的细胞，细胞质浓厚，细胞核较大，约占整个细胞体积的 3/4。分生区细胞进行不断的分裂活动，是植物染色体研究的主要材料。
　　可从多种途径获得根尖材料，取材时应根据种子大小、萌发的特点和所需时间等具体情况从优选择。
　　（1）萌发种子取根种子要求饱满、生活力强，能生长出健壮的种子根。健壮的根尖细胞分裂频率高，染色体形态平直。在最佳生长条件下，根处于最强生长势时取材，此时根尖往往能看到大量乳白色的根毛。根据种子的不同特点选择不同的培养方法。例如，毫米数量级以下、萌发快且不易腐烂的小型种子，换水不方便，可选择滤纸培养法；萌发快且不易腐烂的较小型种子，换水方便，可选择纱布培养法；易腐烂的较大型种子，用蛭石、沙土和锯末培养法；大型种子和小鳞茎材料可选择水培法；珍贵而又稀少的种子或休眠种子可选择试管培养法。
　　（2）鳞茎水培取根适用于百合科和石蒜科鳞茎植株，如洋葱、蒜、水仙、风信子等，注意经常更换新鲜的同温水。
　　（3）扦插取根适用于木本植物或多年生具有地上茎的草本植物，且以扦插繁殖为主，如杨、柳、桑、葡萄、菊花等。
　　（4）从植株上直接取根适用于大多数禾本科植物，如麦类在分蘖期长出的大量不定根。
　　2．茎尖
　　茎尖的分生组织为生长锥和叶原基。在茎尖中，不同部位的细胞分裂的频率和细胞周期长短不同，一般生长锥侧面的叶原基区比中心区的细胞周期时间缩短约 1/2，在取材和观察时应注意这一特点。
　　茎尖适合取材于难以获得种子或种子不易发芽的木本或草本落叶植物，如果树、竹类、木本花卉等，对于根尖坚硬的禾本科植物也可采用茎尖制片。应在生长旺盛季节取材，此时植物生长势强，分生组织细胞分裂旺盛。常绿植物宜在雨季取材，休眠芽不适合取材。在制片方法上，一般用去壁低渗火焰干燥法，压片法效果很差。
　　3．愈伤组织
　　通过植物组织培养可得到愈伤组织，可用于检查所培养的愈伤组织的染色体数目和结构变异情况。在愈伤组织中，细胞分裂比较集中的部位较难以确定，同时细胞分裂受培养条件影响较大。一般以转移到新鲜培养基上 3～7d后取材较适宜，通常在解剖镜下仔细辨认正在生长和已老化的细胞群。老化的细胞体积大且液泡化，因此比较疏松，呈透明状；而分裂旺盛的细胞体积小，细胞核较大，细胞质浓稠，因此显得致密且折光性较强。
　　4．幼叶 在生长发育的早期，幼叶的细胞体积增大，进行旺盛的分裂，因此幼叶也常作为标本片制作的材料。对于幼叶来说，因顶端分生组织的细胞分裂停止较早，居间分生组织的细胞分裂停止较晚，取材时幼叶越小越好，且基部材料优先考虑，如麦类 0.5～25px的幼叶。
　　5．幼小子叶 在双子叶植物中，子叶极为发达，在胚的发育早期进行旺盛的细胞

目录
第一篇 细胞遗传学实验模块
第一章 细胞遗传学实验基础知识 2
第一节 细胞分裂过程中的染色体行为 2
第二节 染色体标本的制备流程 5
第三节 植物染色体显带 12
第四节 染色体核型和带型分析 15
第五节 染色体原位杂交 17
第二章 细胞遗传学实验技术 21
实验一 染色体标本片生物材料的准备 21
实验二 压片法制备染色体标本片 22
实验三 植物花粉母细胞减数分裂的涂抹制片技术 24
实验四 永久标本片的制作 25
实验五 DNA的细胞化学鉴定——福尔根反应 26
实验六 去壁低渗火焰干燥法制备植物染色体标本片 27
实验七 石蜡切片法制备标本片 29
实验八 果蝇唾腺染色体的制片与观察 31
实验九 染色体的核型分析 32
实验十 植物染色体显带技术 35
实验十一 植物染色体原位杂交 36
第二篇 质量性状遗传学实验模块
第三章 质量性状遗传学实验基础知识 44
第一节 质量性状的遗传表现 44
第二节 质量性状的一般分析方法 47
第四章 质量性状遗传学实验技术 54
实验十二 一对及两对相对性状的遗传分析 54
实验十三 果蝇的伴性遗传分析 55
实验十四 果蝇的三点测交 57
实验十五 植物雄性不育性的鉴定及遗传分析 59
第三篇 突变的诱导分析实验模块
第五章 突变的诱导分析实验基础知识 66
第一节 基因突变 66
第二节 染色体结构变异 70
第三节 染色体数目变异 72
第六章 突变的诱导分析实验技术 76
实验十六 植物多倍体的诱导及鉴定 76
实验十七 植物单倍体的诱导和鉴定 77
实验十八 植物的化学诱变及突变体鉴定 80
实验十九 微核的诱发、观察和分析 82
实验二十 大肠杆菌营养缺陷型的诱导和筛选 84
第四篇 分子遗传学实验模块
第七章 分子遗传学实验基础知识 90
第一节 分子遗传学实验的理论基础 90
第二节 分子遗传学的研究方法 94
第八章 分子遗传学实验技术 104
实验二十一 植物 DNA的提取与鉴定 104
实验二十二 PCR扩增技术及扩增产物的检测 106
实验二十三 分子标记连锁图的构建和基因定位 108
实验二十四 外源 DNA与质粒载体的连接 111
实验二十五 大肠杆菌的遗传转化 112
实验二十六 根癌农杆菌介导的植物遗传转化 114
实验二十七 拟南芥原生质体的提取与蛋白质的亚细胞定位 117
实验二十八 植物遗传转化报告基因 GUS的细胞化学鉴定 120
实验二十九 植物基因编辑——CRISPR/Cas9技术 121
实验三十 蛋白质互作分析——酵母双杂交技术 130
第五篇 群体和数量遗传学实验模块
第九章 群体和数量遗传学实验基础知识 134
第一节 群体遗传学基础知识 134
第二节 数量性状遗传实验基础知识 136
第十章 群体和数量遗传学实验技术 141
实验三十一 基因频率和基因型频率的调查与分析 141
实验三十二 植物数量性状遗传率的估算 144
实验三十三 植物数量性状基因座分析 147
主要参考文献 153