第一章绪论
第一节烤烟挂灰烟的简述与理论假设
一、烤烟挂灰烟的简述
挂灰烟是烤烟烘烤过程中极易发生的一类烤坏烟叶，因棕色化反应过度进行导致烟叶表面产生成片灰色或黑褐色的细微小斑点，如同蒙上一层“灰”，故称之为挂灰烟（图1-1、图1-2）。挂灰烟作为烟叶烘烤损失类型（主要包括挂灰烟、烤青烟、烤烂烟和黑暴烟等）中损失昀大的一类，占烤坏烟叶类型比例的30%以上。在烟叶收购上，烤后的挂灰烟颜色发暗、发深，外观等级较差，交售难度大；在烟叶评吸上，香气质差，香气量少，有异味，刺激性强，综合品质下降。
图1-1密集烘烤后的挂灰烟叶与正常烟叶挂竿对比
图1-2密集烘烤后挂灰烟叶与正常烟叶单叶对比
此外，挂灰烟在烟叶烘烤过程中难以避免，原因主要归结于其形成因素的复杂性，包括栽培条件的复杂性和烘烤过程温湿度调控的复杂性，具体表现为：①地域环境条件和微环境的变换；②异常气候的变化；③烤烟品种和叶片着生部位的不同；④栽培条件和烟农种植习惯的改变；⑤烟叶成熟状态和编装烟的差异；⑥烘烤工作人员对烘烤工艺和烘烤设施设备的熟悉掌握程度等。这些复杂因素掺杂在一起，导致我们对挂灰烟认识不足，其发生机理不明，试验重复困难，进而难以提出系统的挂灰烟消减技术与对策，指导生产困难，使之成为烟叶生产中难以避免的烤坏烟叶类型。
二、烤烟挂灰烟的理论假设
大量研究表明，烤烟挂灰烟的形成与酶促棕色化反应紧密相关。烟草中的酶促棕色化反应是指烟叶在调制、醇化和加工过程中由于酶的促进与物质转化，烟叶颜色由黄色逐渐变棕、变褐的过程。通过对前人研究的总结和本研究长期试验的探索，总结出烤烟挂灰烟形成过程中酶促棕色化反应发生的必要条件为：①细胞质膜透性破坏；②烟叶失水不充分；③烘烤温度控制不当。
1）细胞质膜透性破坏是指烘烤过程中，烟叶液泡内的多酚类物质和细胞质内的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等相关反应酶在细胞质膜受损时大量结合和反应。
2）烟叶失水不充分是指烘烤进行到变黄后期时，若烟叶脱水未能超过一定程度，就会增加下一烘烤阶段发生酶促棕色化反应的可能性，即为酶促棕色化反应的底物和酶提供了反应溶剂，从而导致酶促棕色化反应的发生。
3）烘烤温度控制不当是指烘烤过程中不稳定的温度变化（烤房干球温度骤升或骤降）增加了细胞质膜的受损程度，同时增加了反应底物与多酚氧化酶等产生分子碰撞的机会。
在20世纪40年代，Roberts（1941）首次提出了茶叶晾制过程的“酶促棕色化反应”。但在烤烟挂灰烟研究中只是借助该理论进行现象解释，没有进行深入的系统研究（图1-3）。即烟叶中的多酚类物质在多酚氧化酶的作用下，经氧化产生淡红色至黑褐色的O-醌类物质，使烟叶颜色由黄转变为不同程度的深色。该理论验证了反应底物（多酚类物质与多酚氧化酶）、反应条件（气体浓度和温度条件）、细胞质膜透性对整个反应的影响。
图1-3Roberts首次提出的茶叶酶促棕色化反应式①
随着研究的不断深入，人们发现酶促棕色化反应是一个较为复杂的过程，杨树勋（2019）和李玉娥等（2008）总结了烟叶发生酶促棕色化反应的根本原因是烟叶内部酚、醌变化的失衡。在田间生长过程中，无色的多酚类物质（绿原酸、芸香苷、莨菪亭、儿茶酚等）位于液泡内，多酚氧化酶位于细胞质内，在正常代谢的完整细胞中，两种物质处于不同的区隔内，不能大量接触，同时只有少量氧气能进入细胞内，氧化作用弱，酶促棕色化反应不易进行。在烟叶调制、醇化或加工过程中，烟叶的细胞结构遭到破坏，致使酚、酶物质大量接触，氧气大量进入，酶被激活，为酶促棕色化反应创造了条件（李玉娥等，2008）。酶促棕色化反应的实质是多酚类物质在PPO的作用下生成深色的醌类物质，进一步聚合形成复杂的棕色聚合物。
进一步的研究结果认为，酶促棕色化反应发生必须具备的物质为：多酚氧化酶、多酚类物质和活性氧。多酚氧化酶的活性、多酚类物质的含量和活性氧的浓度是影响酶促棕色化反应的重要因素。此外，随着研究的不断深入，人们发现温度、水分等也是影响各种生物化学反应的重要因素，其对烟草酶促棕色化反应的速度也有较大的影响。基于前人的报道，本研究进一步细化了酶促棕色化反应的过程（图1-4）和参与该反应的细胞器及关键要素（图1-5），可以发现这一过程中的电导率、失水率的协调起到至关重要的作用。
图1-4酶促棕色化反应过程
图1-5参与酶促棕色化反应过程的细胞器和关键要素
在酶促棕色化反应中，多酚氧化酶作为关键物质之一，关于其存在部位的研究一直是烟草科技的重点。研究表明，对于除烟草以外的其他作物如马铃薯、豆类、番茄等的多酚氧化酶的存在部位已有较多报道，黄明和彭世清（1998）报道，在细胞化学与细胞免疫化学分析中确认了PPO是一种质体酶，存在于正常细胞的光合组织（如叶绿体类囊体的囊泡）和非光合组织质体（如马铃薯块茎细胞的造粉体）中。王曼玲等（2005）在马铃薯、玉米和杂交杨等植物中的研究表明，PPO前体是在细胞质中合成的，由N端第一段导肽导入叶绿体基质，然后基质中的金属型信号肽酶（signal peptide peptidase，SPP）切除导肽；如果有光，则由N端第二段导肽导入类囊体成为成熟的具有潜在酶活性的酶蛋白。
尹建雄和卢红（2005）等的研究表明，烟草多酚氧化酶是一种铜离子结合酶，在组织发育过程中形成并贮存于叶绿体中。但是基于生物信息学领域对烟草多酚氧化酶是否存在于质体内的定论尚缺乏有力证据，这对于我们能否顺利进行烟草酶促棕色化反应机理和挂灰烟形成机理的系统性研究具有决定性意义。由于对同为茄科的马铃薯和番茄的PPO研究比较透彻，本研究通过同源比对发现烟草的两条PPO序列在N区（N-region）和疏水性类囊体转运区域（thylakoid transfer domain）高度相似（图1-6）。另外通过信号肽预测发现在NtPPO_853的第30个氨基酸（丙氨酸）处具有叶绿体导肽切割位点（图1-7），加之NtPPO_853相比其他三条序列在N端均长了32个氨基酸，推测NtPPO_853的切割机制更为复杂。由此，本研究证实了烟草多酚氧化酶是在质体里面。
图1-6烟草、马铃薯和番茄PPO氨基酸序列的同源比对
红色框：N区；蓝色框：疏水性类囊体转运区域；红色三角形：预测的NtPPO_853的叶绿体导肽切割位点；
Potato：马铃薯；Tomato：番茄
图1-7NtPPO_853导肽的预测
SP（Sec/SPI）：由信号肽酶I裂解的分泌性信号肽；CS：叶绿体定位信号；OTHER：其他潜在信号肽同时，大量研究发现生物酶活性都有各自适宜的温度条件区间，PPO酶活性与温度变化存在显著性相关关系。戴亚等（2001）研究发现PPO在温度20～50℃时保持着较高的活性，并且其活性在40℃左右时昀高，在40℃以下时PPO是相当稳定的，但当温度超过55℃时，易迅速钝化失去活性；雷东锋等（2003）研究烟草中PPO在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃等烘烤温度下的热敏感性，发现35℃时PPO的活性昀高，随着温度的升高，PPO活性逐渐降低。韩富根等（1993）发现在不同温度下烟草PPO的活性或早或迟地都要出现一个高峰，温度越高，活性上升越快，活性越强，酶活性持续的时间越短，反之亦然，当温度在55℃以上时，就会迅速钝化失去活性。本研究也证实了在变黄期转定色期阶段（42～45℃），降温或升温4℃以上，持续1h及其以上，就会出现明显冷、热挂灰。研究还发现冷、热挂灰都与正常烘烤过程中烟叶的相对电导率、氧自由基含量、PPO活性存在显著相关性。
此外，前人研究发现烘烤变黄期结束后，烟叶脱水未能超过40%也会导致挂灰烟的发生。雷东锋等（2003）通过对PPO活性与烟叶水分含量关系的分析，发现水势过高或过低，PPO的活性均较低，但在–872.78kPa的水势条件下，PPO的活性昀高。本研究通过半叶法试验，证实了“硬变黄”烟叶、“缺镁”烟叶、“黑暴烟”在满足烘烤过程进入变黄期转定色期阶段（42～45℃）前失水超过50%的条件下，出现挂灰烟的现象会显著减少。
第二节烤烟挂灰烟的主要影响因素
一、营养元素失调导致挂灰
（一）铁、锰离子中毒烟叶（铁离子中毒：图1-8；锰离子中毒：图1-9）
何伟等（2007）研究发现土壤中铁（Fe）、锰（Mn）等元素含量偏高，在土壤pH偏低和土壤透气性不良的条件下，含量较高的Fe、Mn离子有效性进一步增强，由不易被吸收的高价态还原成容易被植物吸收的低价态离子（Fe3+→Fe2+，Mn4+、Mn3+→Mn2+），从而加剧了烟株对Fe、Mn等离子的吸收和其在体内积累的数量，烟草在体内积累过多Fe、Mn离子后，造成生理性中毒，引起体内的生理生化代谢失调，甚至在多酚氧化酶活性低的情况下，仍有大量挂灰烟产生。
图1-8铁离子中毒烟叶
（二）缺镁烟叶（图1-10）
烟叶缺镁在田间的表现为首先出现老叶的叶尖、叶缘的脉间失绿，叶肉由淡绿转变为黄绿或白色，但叶脉仍保持绿色，进一步发展会致使叶片呈现清晰的网状脉纹。大量研究表明，缺镁烟叶难以烘烤且灰色物质含量增加，烤后呈暗灰色，无光泽或变成浅棕色，油分差，无弹性。王世济等（2010）研究表明随着烟叶缺镁程度的加重，烤后烟叶外观质量变差：颜色变淡、油分减少、身份变薄、叶尖挂灰程度加重、赤星病斑增加；感官质量方面会出现烟叶的余味舒适度变差、杂气变重、刺激性增加、燃烧性变差、综合评分降低、质量档次降低。
图1-9锰离子中毒烟叶
图1-10田间烟叶缺镁导致烤后挂灰（三）老憨烟叶（图1-11）
1.黑暴烟
黑暴烟主要是在土壤肥力高，栽培管理不当，在氮肥特别是铵态氮过多条件下产生
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